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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

Summary

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.

Abstract

Candida albicans é o patógeno mais comum fúngico dos seres humanos, causando cerca de 15% dos casos de infecção hospitalar. Um atributo de grande virulência de c. albicans é sua capacidade de forma de biofilmes, comunidades estruturadas de células anexadas às superfícies bióticas e abióticas. Biofilmes de c. albicans podem formar sobre os tecidos do hospedeiro, tais como camadas da mucosa e em dispositivos médicos, tais como cateteres, marcapassos, próteses e próteses conjuntas. Biofilmes representam desafios clínicos significativos porque eles são altamente resistentes a perturbações físicas e químicas e podem atuar como reservatórios para semente infecções disseminadas. Vários ensaios de em vitro têm sido utilizados para estudar a formação de biofilmes de c. albicans , tais como ensaios de placa de microtitulação, medições de peso seco, ensaios de viabilidade celular e microscopia confocal de varredura do laser. Todos estes ensaios são ensaios de único ponto de extremidade, onde a formação de biofilme é avaliada em um ponto específico de tempo. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a formação de biofilme em tempo real usando um dispositivo automatizado microfluidic sob condições de fluxo laminar. Este método permite a observação da formação de biofilmes como o biofilme se desenvolve ao longo do tempo, usando condições personalizáveis que imitam os do hospedeiro, tais como aqueles encontrados em cateteres vasculares. Este protocolo pode ser usado para avaliar os defeitos de biofilme de mutantes genéticos, bem como os efeitos inibitórios dos agentes antimicrobianos no desenvolvimento do biofilme em tempo real.

Introduction

Candida albicans é um comensal membro a microbiota humana, no entanto, também é um patógeno oportunista, capaz de causar infecções fúngicas superficiais e graves1,2. Uma característica de maior virulência de c. albicans é sua habilidade de forma resiliente e biofilmes resistentes aos medicamentos, comunidades de células aderiram a uma superfície e colocados em uma matriz extracelular material1,3. Biofilmes de c. albicans são altamente estruturados, contendo várias camadas de vários tipos de células (rodada brotamento levedura forma células, as células pseudohyphal ovais e células hifais tubulares)4. Desenvolvimento de biofilmes de c. albicans começa com a adesão de células de levedura-forma redonda para uma superfície (semeando o biofilme), seguida pela proliferação destas células na superfície, e em seguida a maturação do biofilme imaturo estruturar em um totalmente formado o biofilme que está rodeado por matriz extracelular material4. O biofilme maduro é predominantemente composto por células hifais alongadas que formam redes densas e comunicantes, fornecendo a estabilidade arquitetônica para o biofilme4. Durante todo o ciclo de vida do biofilme, leveduras brotamento células dispersarem o biofilme maduro e podem viajar para outras regiões do corpo para causar infecções disseminadas ou semente novas biofilmes em outros sites4,5. C. albicans pode formar biofilmes sobre superfícies bióticas, tais como superfícies mucosas e em todo o tecido do hospedeiro e em superfícies abióticas, tais como cateteres, marcapassos, próteses e articulações protéticas. Devido às propriedades recalcitrantes de biofilmes, que são extremamente difíceis de erradicar, e em muitos casos a estratégia único tratamento eficaz é a remoção do dispositivo infectado4. Assim, é crucial investigar a formação de biofilme em condições semelhantes às observadas em situações clínicas.

Existem várias críticas na vivo modelos animais utilizados para o estudo de c. albicans biofilme formação6,7,8; no entanto, estes estudos podem ser caro e demorado e são limitados pelo número de cepas e agentes antimicrobianos que podem ser testados em um determinado momento. Em vitro biofilme ensaios, por outro lado, permitir a avaliação rápida, elevado-produção de compostos antifúngicos e cepas mutantes e são muito mais cost-effective e ético que ensaios de biofilme transportados para fora no animal modelos9, 10,11,12,13,14. Aqui descrevemos um ensaio em vitro que temos desenvolvido e otimizado para observar a formação de biofilme temporalmente sob fluxo laminar, usando um dispositivo de customizable microfluidic14,15. O ensaio permite a visualização de cada etapa de formação de biofilmes, incluindo a etapa inicial de adesão, proliferação celular, maturação do biofilme e dispersão de célula. O ensaio também é útil para visualizar as alterações de morfologia celular durante o desenvolvimento de um biofilme.

Placas de microtitulação, que são normalmente utilizadas em vitro ensaios de biofilme, enquanto alto throughput, não permito para condições de fluxo controlado. Sistemas de célula tradicional fluxo laminar permitem a avaliação contínua da formação de biofilme em condições de fluxo controlado, mas estas são muitas vezes demoradas para configurar e tendem a ter limitado throughput e controle de faixa dinâmica. O dispositivo microfluidic utilizado aqui supera estas limitações através da combinação de placas de alta taxa de transferência (contendo 48 poços) com uma câmara interna de fluxo laminar e é altamente reprodutível, versátil e personalizável.

Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de um dispositivo disponível comercialmente microfluidic automatizado para avaliar a formação de biofilmes de um selvagem-tipo c. albicans Coe, os efeitos de um agente antifúngico conhecido no desenvolvimento de um biofilme e biofilme formação em duas cepas mutantes (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) que anteriormente foram relatados para ter o biofilme defeitos in vitro e in vivode17,16,18. O protocolo descrito pode ser usado para testar a eficácia de agentes antimicrobianos em inibir a formação de biofilme por meio do desenvolvimento de um biofilme e identificar os genes necessários para o desenvolvimento de biofilme normal selecionando bibliotecas mutantes.

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Protocol

1. preparação da cultura de pilha fúngicas

Nota: Cultura de células de conduta trabalhar (ou seja, abertura criogênicos estoque tubos, tubos de cultura celular e frascos) dentro de uma armário de biossegurança. Ligue h de lâmpada germicida pelo menos 1 de ultravioleta (UV) do armário antes do trabalho e desligar a lâmpada UV enquanto trabalhando ativamente no armário. Use luvas, óculos de segurança e equipamento de protecção adequado e descontaminar a superfície da bancada e pipetas com etanol a 70% antes do início do experimento. Recomenda-se uso de dicas de filtro estéril e familiaridade com técnicas básicas de microbiológicas assépticas.

  1. Cepas de c. albicans raia (tipo selvagem, bcr1 Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) na levedura extrato médio de glicose (YPD) peptona (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, glicose 2%; pH 6,8) placas de ágar. Incube a 30 ° C, durante 48 h, seguir práticas microbiológicas padrão19.
  2. Selecione uma única colônia isolada da placa para inocular em 4 mL de meio líquido YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, glicose 2%; pH 6,8) e incube a 30 ° C com agitação a 225 rpm em um padrão tremendo incubadora para 12-15 h, seguir padrão microbiológico prac tices19.
  3. Determinar a densidade de células da cultura através da medição de densidade óptica (OD) em 600 nm em uma cubeta (1 mL, 1 cm de comprimento de caminho), seguir padrão microbiológico práticas19.
  4. Diluir a cultura de célula para um final OD600 de 0.5, equivalente a 2 x 107 células/mL, no meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (contendo 165 mM 3-morpholinopropane-1-sulfônico (MOPS), L-glutamina e sem sódio bicarbonato, pH 7,0) ou meio de aranha (caldo nutriente de 1%, 1% de manitol, 0,4% K2HPO4, pH 7,2).
    Nota: A mídia alternativa pode ser usada para apoiar o crescimento de cepas de interesse.
    Nota: Não faça diluições de célula demasiada antecedência. É aconselhável começar diluições depois passo 3.3 (descrito abaixo), a fim de evitar o início da formação de hifas antes células sendo propagada no canal de visualização.

2. preparação dos canais microfluídicos da placa Microfluidic

Nota: Consulte manual do usuário do sistema microfluidic (ver tabela de materiais) para obter informações sobre placas e configuração do instrumento.

  1. Antes de executar o experimento microfluídicos, quente 20 mL de RPMI 1640 mídia ou mídia de aranha em uma incubadora a 37 ° C. Volume de mídia adicionais pode ser necessário com base em cálculos na etapa 2.8. Pré-aquecimento da mídia impede a formação de bolhas de ar durante o experimento.
  2. Ligue o sistema de microfluídica que inclui o controlador, as duas unidades de alimentação, o microscópio, a câmera, e computador ligado ao sistema. Abra o software que controla o sistema (veja a tabela de materiais) no menu do programa no computador. Duas janelas aparecerão uma vez que o programa é aberto.
  3. Localize o número de código de barras da placa em uso e entrada o número quando solicitado pelo software. Use duas telas de computador separado para exibir o software em duas janelas. Uma janela (módulo de controle) contém os controles para a placa e a segunda janela (montagem, módulo de imagem) contém os controles para o microscópio e câmera.
  4. Ligue o botão de alimentação do aquecedor no controlador e definir a microfluídica temperatura do sistema, a 37 ° C, usando os botões de seta no controlador de temperatura.
  5. Limpe a placa de interface (Figura 1), usando água estéril como segue. Pulverizar a parte inferior da placa com água estéril e usar lente papel para remover a sujeira/poeira. Descanse a placa de interface voltada para baixo no papel de lente limpa para secar ao ar. Limpe o topo da placa de interface usando papel de isopropanol e lente de 70%.
    Nota: A placa de interface conecta o sistema microfluidic a placa que irá conter as células e a mídia. Certifique-se de que nenhum líquido permanece e que todas as fibras e a sujeira são removidos. Limpeza inadequada pode resultar em vídeos e imagens de baixa qualidade.
  6. Retire os tubos na placa de interface de condensação.
    1. Deixe o placa de bruços repousando sobre o papel da lente. No controle de janela de módulo clique sobre o modo manual para a placa. Na seção menu do controle de cisalhamento, clique sobre a seleção de fluidos para colunas 1-4 e 5-8 e selecione o menu drop-down a 37 ° C. Na seção controle de cisalhamento, definir o modo de fluxo constante e definir o cisalhamento máximo 2 Dina/cm2 (0.2 Pa) (Figura 2A).
    2. Clique sobre os poços de entrada para iniciar o fluxo de ar estéril através dos tubos de placa de interface para remover a condensação. Depois de 5 min, clique no botão parar na seção de controle de placa bem (Figura 2A). Observe os tubos na placa de interface para confirmar que todos condensação foi removida. Se as gotas são ainda visíveis, repita o fluxo de ar estéril, como mencionado acima, por mais 5 minutos.
      Nota: Os tubos de entrada são anexados aos filtros de 0,22 micron para garantir que somente o ar estéril é introduzido ao sistema microfluídica. O fluxo pode ser monitorado pelo log de evento na tela na janela de módulo de controle.
  7. Coloque a placa de microfluidic de Dina de 0-20 48-bem no palco microscópio.

3. formação de biofilmes de candida albicans no sistema Microfluidic

  1. Para gravar a formação de biofilmes, adicione 600 µ l de pré-aquecido meio RPMI-1640 ou meio de aranha nos poços de entrada (ver Figura 1 para layout de placa). Tenho duas repetições para cada condição experimental.
    1. Para testar a formação de biofilmes de c. albicans as estirpes de tipo selvagem e mutantes, adicionar meio de aranha 600 µ l para poços de entrada da placa de experiência.
    2. Para testar a formação de biofilme na presença de drogas antifúngicas (ou outros compostos de interesse), adicionar 600 µ l de meio RPMI-1640, dois poços (controle negativo) e 600 µ l de meio RPMI-1640, suplementado com anfotericina B (16 µ g/mL) (ou a droga de escolha no desejado concentração) para dois outros poços de entrada.
      Nota: Para uma experiência de formação de biofilme de 12 h, adicione 600 µ l de mídia previamente aquecida nos poços de entrada. Para experiências mais adicionar mídia adicional (50 µ l/h) para os poços de entrada. Não exceda o volume máximo do poço (1.500 µ l).
  2. Abaixe lentamente a placa de interface limpa em cima da placa de 48 microfluidic bem. Deslize a placa de interface ligeiramente para a esquerda até os tubos na placa de interfase são posicionados no topo dos poços de entrada e saída.
Gire a alavanca na placa de interface da esquerda para a direita para bloquear a placa de interface em posição, garantindo que o experimento é hermético.
Nota: O fluxo de ar estéril dos tubos na placa de interface vai empurrar o líquido em poços de entrada ou saída (dependendo da direção selecionada usando o software no computador), para que o líquido flui através do canal de visualização entre a entrada e saída poços na direção personalizada e velocidade ditada pelo usuário.
  • Na seção controle de cisalhamento, definir o modo de fluxo constante e definir o cisalhamento máximo 1 Dina/cm2 (0,1 Pa). Clique em poços de entrada com a mídia para começar o fluxo de mídia de entrada para poços de tomada (Figura 2A) para aprontar o canal. Depois de 5 min clique no botão parar na seção de controle de placa bem. Retire a placa de interface e observar os poços da placa microfluidic. Após a preparação dos canais, apenas uma pequena gota de mídia deve ser visível em poços de tomada. Se a queda não é visível, prime os canais em incrementos de 2 min, até que a pequena queda de mídia em poços de tomada é visível.
    Nota: A preparação é necessária para remover o ar do canais de visualização e certifique-se de que os canais estão cheios de mídia desejada.
  • Remova a placa de interface da placa de microfluidic e coloque-a em uma superfície estéril. Adicione 50 µ l de cultura celular (descrita na etapa 1.5) em cada tomada bem.
    1. Para o teste de c. albicans as estirpes de tipo selvagem e mutantes, adicionar 50 µ l de cultura de células do tipo selvagem (SC5314) em mídia aranha dois poços de tomada, bcr1 Δ/Δ na mídia de aranha para dois poços de tomada e efg1 Δ/Δ na mídia de aranha para dois poços de tomada. Coloque a placa de interface volta na chapa de microfluidic e bloqueio da tampa (veja a Figura 1 para layout de placa).
      Nota: Conforme descrito na etapa 3.1.1, todos os poços de entrada correspondentes contém mídia de aranha.
    2. Para testar a formação de biofilmes de c. albicans na presença de anfotericina B ou outro composto de interesse, adicione 50 µ l de cultura de células do tipo selvagem (SC5314) em meio RPMI-1640 para quatro poços de tomada. Coloque a placa de interface volta na chapa de microfluidic e bloqueio da tampa (veja a Figura 1 para layout de placa).
      Nota: Conforme descrito na etapa 3.1.2, todos os poços de entrada correspondentes contém mídia RPMI-1640 com e sem a anfotericina B ou outros compostos de interesse.
  • Na seção controle de cisalhamento, definir o modo de fluxo constante e definir o cisalhamento máximo 2 Dina/cm2 (0.2 Pa). Clique em poços de tomada com células para começar o fluxo de mídia de entrada para poços de tomada (Figura 2A) para iniciar a semeadura de c. albicans. Após 3 Clique em s, o botão de parar no controle de placa bem seção para impedir a entrada os entrada poços de células.
    Nota: As células são movidas dos poços de tomada em direção aos poços de entrada; é essencial que o fluxo é interrompido antes que as células atinjam os poços da entrada. Isso garante que os poços de entrada não se contaminado com cultura de células e que os meios de comunicação em poços de entrada permanece estéril para a duração do experimento. A força de cisalhamento e tempo necessário baseia-se a viscosidade da mídia utilizada e o tamanho das células.
  • Permitir que as células para permanecer parado com nenhum fluxo (0 Dina/cm2) por 10-20 min no canal de visualização para aderência de célula inicial. Durante esta etapa de adesão de 10-20 min, configurar o computador para capturar as posições de estágio de câmera e começar a aquisição de imagens previamente niveladas (descritas em detalhes nas seções 4-6).

    • 4. configurar as posições de estágio para o experimento de Microfluidic

    Nota: As posições de estágio e calibração da placa devem ser definidos antes de começar o experimento. Esta configuração permite que o computador armazenar as posições de cada canal de visualização para capturar as imagens durante o experimento. A placa microfluidic não deve ser perturbada depois de configurar as posições de estágio. Se a placa for movida, as posições de estágio terá que ser reposto antes do início do experimento.

    1. Use o software de análise de visualização (ver tabela de materiais) para definir o cenário de posição; cada canal de visualização é uma fase (1-24) (Figura 1) e cada fase tem três sub-fases (1-3) para captura de imagem em diferentes posições ao longo do canal de visualização (Figura 1). Na janela de módulo de imagem, abra o módulo de 'Multi-dimensional aquisição' (MDA), clicando na guia MDA (Figura 2B).
    2. No MDA módulo clique na guia 'Estágio' no menu do lado esquerdo (Figura 2B). Na seção de estágio, carrega a lista de palco principal para a placa de microfluidic dyne 20 bem 0 - 48. Cada canal de visualização deve ter três etapas para aquisição de imagens.
    3. Abra o 'Amostra Reload ajuste' (SRA) e 'Estágio de mover a posição absoluta' módulos (mapa), clicando na guia SRA e guia mapa (Figura 2B). No módulo de SRA, pressione o botão de 'Live' para ver um preview de imagem com mira.
    4. Usando o joystick, posicione a placa bem tal que a ponta da seta (fisicamente localizada na placa) adjacente ao canal 4 de visualização se alinha com a mira no software. No menu de mapa, pressione o botão 'Definir origem' (Figura 2B). A posição atual agora deve ler 0 em X, Y e Z.
    5. No módulo de SRA, clique na seção 'Pontos de referência inicial' no menu do lado esquerdo (Figura 2B). Clique em 'Carregar configurações' e carregar o arquivo para a placa de microfluidic dyne 20 bem 0 - 48.
    6. Na seção de estágio do módulo MDA, clique duas vezes em ' palco posição 22,2'. Esta posição indica o meio (sub fase 2), da visualização do canal número 22. Isto trará o microscópio que visualizaram o palco e o foco da câmera em estreita proximidade com o marcador de seta exibindo canal 22. Usando o joystick, posicione a placa bem tal que a ponta da seta (fisicamente localizada na placa) adjacente ao canal 22 de visualização se alinha com a mira.
    7. Copie a coordenada Y do módulo MDA para a posição Y do ponto 2, na aba 'Pontos de referência de atualização' do módulo SRA (Figura 2B).
    8. Na guia 'Posições de estágio de atualização' da SRA, clique em 'Aplicar a lista de palco MDA' (Figura 2B).
      Nota: Isto irá atualizar todos que visualizaram posições de estágio na placa (1-24) para ser calibrado para a posição de placa microfluidic específico no palco microscópio.
    O prato está pronto para a aquisição de imagens e usará as posições de estágio calibrado para mover-se durante a captura de imagens de três posições em todos os 24 canais de visualização.

    5. criação de aquisições para imagem capturar durante o experimento Microfluidic

    1. Na janela de módulo de imagem, use o módulo MDA e clique na guia 'Salvar' no menu do lado esquerdo (Figura 2B). Selecione o nome do arquivo para o experimento e a pasta para armazenar as imagens adquiridas no computador.
    2. No módulo de MDA, clique na guia 'Timelapse' no menu do lado esquerdo e configurá-lo para adquirir 145 imagens totais; Defina o timelapse entre imagens a 5 min. Isso resultará em 1 imagem cada 5 min para uma experiência de desenvolvimento de biofilme de 12 h.
      Nota: O intervalo de tempo entre as imagens e o número total de imagens pode ser ajustado com base nos requisitos experimentais. Se a imagem por mais de 12 h, adicione mídia adicional nos poços de entrada no passo 3.1 para assegurar que os poços não secar. Para experiências mais adicionar mídia adicionais, conforme necessário (50 µ l/h) para os poços de entrada.
    3. No módulo de MDA, clique na guia 'comprimentos de onda' no menu do lado esquerdo (Figura 2B) e definir o número de comprimento de onda para o experimento como 1. Definir o comprimento de onda para capturar em 50% Brightfield e 50% câmera com um tempo de exposição de 12-20 ms, ganho de 0,6 e digitalizador de 20 MHz.
      Nota: Comprimentos de onda adicionais podem ser usados, incluindo os comprimentos de onda para a imagem latente de fluorescência (por exemplo, podemos ter com sucesso visualizado mCherry e cepas GFP marcado c. albicans usando este dispositivo microfluidic). Os parâmetros de aquisição também podem ser alterados com base nos requisitos experimentais. Por exemplo, configurar uma segunda onda e selecionando 'Autofocus em cada commit' e um comprimento de onda terceiro e selecionando 'Autoexposure em cada commit' é recomendado para iniciantes para maximizar as oportunidades de aquisição de imagem que estão em foco.
    4. No módulo de MDA, selecione as abas de lista de estágio no menu da esquerda. Estágios 1,1 – 24,3 será exibida. Um por um, clique em cada estágio e use as configurações de foco fino para focar manualmente as células no canal de visualização para cada fase. Uma vez que o campo de visão está em foco, clique na seta preta ao lado da lista de palco para atualizar e salvar as configurações para cada fase. O computador usará essas configurações de posição definida manualmente e focal para adquirir imagens em cada ponto de tempo. Remova qualquer estágios não utilizados da lista usando a seta para 'Remover'.
      Nota: O módulo MDA e o programa referem exibindo canais como fases alternadamente, e a mesma terminologia é usada pelo software.

    6. executando o experimento Microfluidic

    1. Na janela de módulo de imagem, usando o módulo MDA, selecione 'Adquirir' para começar a captura de imagens previamente niveladas de células aderidas para todas as sub fases (Figura 2B).
      Nota: A janela de módulo de imagem e os controles de câmera agora mostrará imagens que são capturadas e o módulo de mapa, MDA e SRA deixará de ser visível. As imagens capturadas também mostrará um temporizador do lado, para indicar o número de imagem a ser capturado e o lapso de tempo antes que começará o próximo ciclo de captura de imagem. Espere por uma rodada de imagens a serem capturadas antes de prosseguir com o próximo passo.
      Nota: Não utilize os botões de 'Pause' ou 'Mark evento' na tela de imagem para a janela de módulo. A partir daqui durante o experimento, mantenha o mouse apenas na janela do módulo de controle na tela do computador (Figura 2A) segunda. Isto é importante para evitar perturbar a janela de módulo de imagem.
    2. Em estadia de janela módulo o controle sobre o modo manual para a placa. Na seção controle de cisalhamento, definir o modo de fluxo constante e definir o cisalhamento máximo 1 Dina/cm2 (0,1 Pa). Clique em poços de tomada O1, O7, O13 e O19 para iniciar o fluxo de mídia de entrada para poços de tomada (Figura 2A) para remover as células não-aderido. Depois de 5 min clique no botão parar na seção de controle de placa bem. Permitem uma segunda rodada de imagens para serem adquiridos. Imagens podem ser visualizadas e o lapso de tempo pode ser monitorado na segunda tela na janela de módulo de imagem.
    3. Na seção controle de cisalhamento, ajustar o fluxo de cisalhamento máximo 0,5 Dina/cm2 (0,5 Pa) clicando sobre o número no máximo cisalhamento coluna e usar o teclado para digitar 0.5. Pressione a tecla enter no teclado e confirmar a alteração na taxa de fluxo no log de eventos na janela de módulo de controle (Figura 2A). O experimento deixe intacta no escuro por 12h.
      Nota: A exposição à luz e movimento/vibrações podem reduzir severamente a qualidade das imagens adquiridas durante todo o experimento. No final do experimento microfluídicos, a janela de módulo de imagem não mostrará quaisquer imagens e reverte para visualizar os módulos SRA, mapa e MDA. O software da imagem latente do módulo pode ser usado para visualizar as imagens, montar os vídeos e quantificar o biofilme formado (descrito abaixo).

    7. analisar os resultados

    1. Na janela de módulo de imagem, selecione a aba 'Ferramentas de análise' e clique em 'Análise multi-dimensional dados' (RMD) da lista suspensa para baixo o menu. No módulo de RMD, clique em 'Selecionar arquivo de Base'. Isto abrirá a janela as utilidades do conjunto de dados multi-dimensional'.
    2. Clique no botão 'Selecionar diretório' e escolha a pasta que foi usada para salvar o experimento na etapa 5.1. Na lista de 'conjuntos de dados ', selecione o experimento de arquivo de log (extensão de ND). Uma vez que o log é carregado, clique no botão 'Ver'.
    3. Selecione o comprimento de onda, clicando sobre as opções no menu 'Comprimentos de onda' da esquerda e escolha a posição de palco para exibir um menu suspenso. Escolha a imagem para carregar a partir os números na parte superior do módulo clicando com o número de imagem. Uma vez selecionado, clique no botão 'carregar imagem (ns)' para carregar as imagens. Você pode exibir uma imagem ou todas as imagens de uma só vez.
    4. Selecione todas as imagens para fazer o vídeo de um lapso de tempo. As imagens selecionadas serão aberto como um vídeo em uma nova janela. Clique na guia 'arquivo' na janela de módulo de imagem e escolha 'salvar como' no menu suspenso. Salve o vídeo resultante do arquivo padrão (TIFF/MetaSeries).
    5. Abrir e carregar o arquivo de vídeo salvo usando software ImageJ. No ImageJ, clique na guia 'arquivo' e clique em 'salvar como'. Escolher o menu drop-down '. avi' e converter o arquivo para um arquivo. avi usando a conversão JPEG definida como 10 quadros/s.
      Nota: A velocidade do vídeo pode ser ajustada alterando os quadros/s.
    6. Para quantificar os biofilmes, repita as etapas de 7.2, 7.3 e 7.4.
    Escolha a última imagem (número 144) e clique no botão 'carregar imagem (ns)' para carregar a imagem. A imagem abrirá em uma nova janela. Clique no botão 'imagem de limiar' e selecione 'Inclusive' limiar. Mova o cursor até as células do biofilme são de cor vermelha, e regiões com nenhuma célula não são coloridas.
  • Clique no botão 'Log aberto' para efetuar medições (o botão irá exibir 'Open Log' apenas inicialmente; uma vez que um registro é ativo o botão será renomeado para ' F9: dados de Log'). Na janela 'Log de dados aberto', selecione 'Intercâmbio dinâmico de dados' e clique em 'okey.'
  • Na janela de módulo de imagem, selecione a guia 'Análise ferramentas' e clique em 'Mostrar estatísticas de região'. Isto irá abrir uma nova janela exibindo as medições da imagem. Selecione 'Imagem inteira' nas opções 'Medida' disponíveis e clique em ' F9: Log dados.' Será exibido um arquivo do excel com todas as medições. Localizar os valores de 'Área' e ' Thresholded' e dividir o último pela antiga para obter um valor numérico para a área ocupada pelo biofilme.
    Nota: A 'área' para cada imagem obtida durante o experimento é idêntica e, portanto, a medição 'Área Thresholded' pode ser usada para avaliar as diferenças na formação de biofilme entre estirpes de tipo selvagem e estirpes mutantes ou avaliar a eficácia do drogas testadas na formação de biofilmes.

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    Representative Results

    Realizamos o ensaio biofilme microfluidic descrito aqui usando um selvagem-tipo tensão de c. albicans em condições dois media (mídia RPMI-1640 e aranha), a estirpe selvagem-tipo, na presença do conhecido antifúngico anfotericina B (16 µ g/mL) em RPMI, e duas cepas mutantes anteriormente relataram para ter defeitos na formação de biofilme (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) na mídia de aranha.

    Vídeo 1 mostra o desenvolvimento de um biofilme de tipo selvagem em meio RPMI-1640 e os efeitos da droga antifungal, anfotericina B, na formação de biofilmes. Sob condições de tipo selvagem, várias células aderem fortemente para o canal, as células formam hifas que o tempo avança e um biofilme espesso pode ser observado com intercalante hifas e células de levedura. No final do experimento microfluídicos, o biofilme do selvagem-tipo preenche completamente o canal de visualização. A presença de anfotericina B, no entanto, tem um efeito pronunciado sobre a redução do biofilme. Especificamente, a aderência de células é diminuída, e, ao contrário de condições não tratadas, na presença de anfotericina B, várias células podem ser vistas fluindo para fora com o fluxo de cisalhamento dos meios de comunicação. Como o tempo avança, o não células hifas de formulário e um biofilme não se formou. Essas diferenças também são mostradas na Figura 3, que retrata o tempo 4-pontos de ensaio às 0 h, 2 h, 6 h e 12 h.

    Vídeo 2 mostra o desenvolvimento de um biofilme selvagem-tipo e dois anteriormente relataram mutantes de biofilme com defeito (bcr1 Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) em mídia de aranha. Ambas as cepas Δ/Δ Δ/Δ e efg1 de bcr1 mostram a formação de biofilme severamente reduzida em comparação com a estirpe selvagem-tipo isogénicas. Para a tensão Δ/Δ efg1 , observamos que as células aderidas não formam hifas e o biofilme resultante é gravemente defeituoso. Para a tensão Δ/Δ bcr1 , observamos que não só é a tensão Δ/Δ bcr1 com defeito na formação de biofilmes, mas também exibe uma adesão clara desertar, onde as células podem ser vistas flutuando na direção do fluxo de cisalhamento como falham a aderir a canal de visualização. Essas diferenças também são mostradas na Figura 4, que retrata a 4 pontos do tempo de ensaio às 0 h, 2 h, 6 h e 12 h.

    Figure 1
    Figura 1: Microfluidic instrumento utilizado neste experimento. Painel A mostra o instrumento microfluidic usado, painel B mostra a placa de interface, painel C mostra um esboço esquemático de um canal de visualização única (palco) e três sub-fases, capturados pela câmera durante o experimento, e painel D mostra um contorno esquemático da placa microfluidic 48-bem usado com um esquema da poços e saídas de ar e a janela de visualização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 2
    Figura 2: sistema de controlo Select screenshots de imagem modulesoftware e microfluidic placa. Painel A mostra o módulo de controle, que contém os controles para a placa de microfluidic, e painel B mostra a janela de módulo de imagem, 'Palco mover para posição absoluta' módulo (mapa), o módulo de 'Multi-dimensional aquisição' (MDA), e o módulo de 'Amostra Reload ajuste' (SRA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 3
    Figura 3: exposição a anfotericina B resulta em defeitos de formação de biofilme. Visualização de tempo dependente da formação de biofilme em mídia RPMI-1640 (coluna 1) e mídia RPMI-1640, suplementada com 16 µ g/mL anfotericina B (coluna 2) sob fluxo dinâmico (0,5 Dina/cm2) a 37 ° C para pós-aderência 12h no sistema microfluidic. H 0 representante (lavagem pós-aderência e inicial), 2 h, 6 h e 12 h imagens (de cima para baixo) são mostradas para a estirpe selvagem-tipo isogénicas SN250 (colunas 1 e 2). Barras de escala são 20 µm em cada painel. Vídeos de lapso de tempo correspondente da formação de biofilmes são fornecidos em Video 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 4
    Figura 4: Exclusão de BCR1 ou EFG1 resulta em defeitos de formação de biofilme. Tempo visualização dependente da formação de biofilmes nos meios de comunicação de aranha (colunas 1-3) sob fluxo dinâmico (0,5 Dina/cm2) a 37 ° C para pós-aderência 12h no sistema microfluidic. H 0 representante (lavagem pós-aderência e inicial), 2 h, 6 h e 12 h imagens (de cima para baixo) são mostradas para a estirpe selvagem-tipo isogénicas SN250 (coluna 1), bcr1Δ/Δ estirpe (coluna 2) e efg1 Δ/Δ estirpe (coluna 3). Barras de escala são 20 µm em cada painel. Vídeos de lapso de tempo correspondente da formação de biofilmes são fornecidos em vídeo 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

    O ensaio de biofilme microfluidic personalizável descrito aqui permite a visualização da formação de biofilme em tempo real em um nível de célula única quando exposto a um fluxo laminar de taxa fixa e a temperatura constante. Ele fornece um meio poderoso para estudar o desenvolvimento de biofilmes em estirpes de tipo selvagem e mutantes, e observaram os efeitos de tratamentos de agente antimicrobiano em biofilmes nas condições que imitam condições fisiológicas em situações clínicas. Ao contrário da maioria em vitro biofilme ensaios, esse método permite o exame de um desenvolvimento do biofilme em tempo real como forma.

    Esse método pode ser usado de uma forma de alta produtividade, onde até 24 amostras podem ser executadas simultaneamente para avaliar a formação de biofilme. O método também pode ser usado para conduzir telas genéticas de mutantes bibliotecas para identificar genes necessários para o desenvolvimento de biofilme normal e pode ser usado para avaliar a efetividade contra biofilmes de compostos antimicrobianos de interesse em telas composto de biblioteca. Antecipamos que as aplicações futuras deste dispositivo microfluidic incluirá essas telas. Notamos, no entanto, que determinados testes de tratamento de drogas serão limitada pela espessura do biofilme formado usando este dispositivo microfluidic como biofilmes crescidos para > 16 h tendem a obstruir o canal de visualização. Assim, experimentos de testes de drogas precisa ser executada para < 16 h.

    Em geral, este dispositivo é altamente customizável e versátil e pode ser ajustado para avaliar diferentes espécies microbianas em reinos, vazões, temperaturas, tempos de incubação e mídia. O método descrito fornece informações sobre um número de diferentes aspectos da formação de biofilmes, incluindo a aderência de célula inicial, maturação do biofilme e dispersão de célula. Embora apenas relatamos os resultados para a formação de biofilmes de único-espécies aqui, esse protocolo também pode ser adaptado para estudar a formação de biofilmes de dual - e misturado-espécie.

    Dois passos são fundamentais para executar com êxito este protocolo. Primeiro, as bolhas de ar no sistema devem ser evitadas por pré-aquecimento da mídia na temperatura experimental. Um erro comum é a diluição das células na mídia que não foi pré-aquecido. As células devem ser diluídas na mesma mídia que está sendo usada para os poços de entrada. Segundo, o fluxo de células de saída a entrada poços devem ser cuidadosamente monitorizados; Se as células de fluxo muito longe, os meios de comunicação de entrada irão tornar-se contaminado e o experimento não produzirá resultados interpretáveis. Por outro lado, se as células não são permitidas para mover todo o caminho para o canal de visualização, então não há células será visíveis no canal durante o experimento, levando a imagens em branco. Pontos-chave adicionais para manter em mente são que o volume e movimento entre os poços da placa microfluidic estão ligados entre si para cada coluna, e é importante manter a tanta consistência de mídia quanto possível (com semelhante viscosidade, densidade, de células e composição) e da mesma forma tamanho células (se possível), como meios diferentes e tamanhos diferentes de célula terá taxas de fluxo diferentes na coluna. Durante o experimento, o recuo das células é monitorado usando um microscópio; no entanto, apenas dois canais podem ser vistos em uma vez (usando um objectivo X 10). Assim, é altamente recomendado para executar um experimento de simulação para medir o tempo necessário para o fluxo de saída para poços de entrada usando as células e meios previstos para serem usados no experimento real.

    Em geral, recomendamos a utilização deste teste de biofilme microfluidic como um ensaio em vitro para ser utilizado antes na vivo testes em animais. O ensaio, no entanto, ainda é um ensaio em vitro e resultados precisará ser validados em modelos animais relevantes. Em nossas experiências, os resultados deste teste de biofilme microfluidic tiveram o melhor valor preditivo para na vivo o biofilme ensaios em comparação com outros ensaios em vitro avaliamos14.

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    Disclosures

    Clarissa J. Nobile é dos fundadores da BioSynesis, Inc., uma empresa de desenvolvimento de inibidores e diagnósticos de biofilmes de c. albicans .

    Acknowledgments

    Agradecemos a todos os membros do laboratório Nobile para discussões úteis sobre ensaios de biofilme. Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) grant R21 AI125801 (C.J.N.). DLR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Universidade de California Institute para o México e os Estados Unidos (UC-MEXUS) e o Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
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    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
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    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Tags

    Doenças infecciosas edição 130 biofilme Candida albicans visualização dispositivo microfluidic ensaios de biofilme em vitro métodos de biofilme protocolos de biofilme telas de biofilme fluxo laminar
    Visualização da formação de biofilmes de <em>Candida albicans</em> , usando um dispositivo Microfluidic automatizada
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    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, … More

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

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