In Vivo Monitoraggio dell'espressione genica orologio circadiano nel nucleo soprachiasmatico Mouse mediante fluorescenza reporter
Summary
Questa nuova tecnologia basata sulla fluorescenza consente il monitoraggio a lungo termine della trascrizione dei geni dell’orologio circadiano nel nucleo soprachiasmatico (SCN) di topi liberi di muoversi in tempo reale e ad alta risoluzione temporale.
Abstract
Questa tecnica combina fibra ottica mediata fluorescenza registrazioni con la consegna precisa dei reporter gene ricombinante virus adeno-associato basato. Questo sistema monitoraggio nuovo e facile da usare in vivo di fluorescenza è stato sviluppato per registrare il ritmo trascrizionale del gene dell’orologio, Cry1, nel nucleo soprachiasmatico (SCN) di topi liberi di muoversi. A tal fine, un reporter di fluorescenza di trascrizione Cry1 è stato progettato e confezionato in virus Adeno-associato. Purificata, concentrato di virus è stato iniettato nel mouse SCN seguita dall’inserimento di una fibra ottica, che è stato poi fissata sulla superficie del cervello. Gli animali sono stati restituiti alle loro gabbie casa e concesso un periodo di recupero post-operatorio 1 mese assicurare sufficiente reporter espressione. Fluorescenza è stato poi registrato in topi liberi di muoversi attraverso un in vivo monitoraggio sistema che è stato costruito alla nostra istituzione. Per l’ in vivo sistema di registrazione, un laser a 488 nm è stato accoppiato con un divisore di fascio 1 × 4 che divide la luce in quattro uscite di eccitazione laser di pari potenza. Questa impostazione ci ha permesso di registrare contemporaneamente da quattro animali. Ciascuno dei segnali di fluorescenza emessa è stato raccolto tramite un tubo di fotomoltiplicatore e una scheda di acquisizione dati. Al contrario per la bioluminescenza in vivo registrazione orologio circadiano tecnica precedente, questa fluorescenza in vivo sistema di registrazione ha permesso la registrazione dell’espressione genica orologio circadiano durante il ciclo di luce.
Introduction
Nei mammiferi, il nucleo soprachiasmatico (SCN) governa il ritmo circadiano del corpo intero per coordinare la risposta di un individuo a cambiamenti ambientali esogeni (ad es., luce, temperatura, stress, ecc.)1. Componenti di base orologio consistono di Per1-3, Cry1-2, orologioe Bmal1e svolgono un ruolo centrale nel regolare l’orologio circadiano di ciascuna cella. Ogni cella in SCN contiene l’attivatore trascrizionale, orologio/BMAL1, che agisce come un eterodimero di indurre l’espressione di PER e piangere. Il PER / CRY complesso quindi inibisce la funzione di orologio/BMAL1 per formare un ciclo di feedback di trascrizione-traduzione che prende circa 24 h a completa2,3.
Gli studi precedenti su SCN principalmente impiegato l’ex vivo SCN fetta cultura metodo4,5,6 e, mentre questo approccio ha fornito preziose informazioni, suoi limiti hanno inibito la nostra capacità di ottenere i dati per quanto riguarda l’influenza di altri nuclei di cervello su SCN, come pure l’effetto di stimoli esogeni (ad es., luce) sulle cellule che risiedono in questa regione critica. Nel 2001, gruppo di Hitoshi Okamura è stato il primo ad utilizzare il sistema di bioluminescenza per in vivo l’espressione genica monitor orologio circadiano in SCN in topi7liberi di muoversi. Gruppo di Ken-ichi Honma ha trascorso alcuni anni sviluppando ulteriormente la bioluminescenza in vivo sistema di registrazione in SCN8,9,10. Insieme, questi studi hanno fornito i ricercatori con la possibilità di monitorare l’orologio circadiano in costante oscurità o dopo un impulso di luce. Tuttavia, poiché la bioluminescenza è troppo debole per consentire il monitoraggio continuo durante il ciclo luce/buio, accoppiato con il fatto che la luce è il predominante segnale necessario per il trascinamento di SCN-mediata di orologi circadiani11, c’è la crescente domanda per lo sviluppo di metodi sperimentali che superare i limiti associati con registrazione di bioluminescenza. Il rapporto corrente descrive un sistema basato su fluorescenza che è stato costruito per monitorare l’orologio circadiano del SCN in vivo in topi liberi di muoversi. Questo metodo facile da usare consente un monitoraggio continuo durante il ciclo luce/buio e per l’osservazione a lungo termine della trascrizione dei geni dell’orologio circadiano in SCN in tempo reale e ad alta risoluzione temporale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrariamente ai metodi di ex vivo , come fetta cultura4,5, RT-PCR16e in situ ibridazione17, che richiedono che gli animali abbattuti, l’ in vivo registrazione metodo consente ricercatori a studiare l’espressione genica circadiana in un animale vivente. Come tale, questa tecnologia offre la possibilità di valutare l’effetto delle perturbazioni fisiche differenti (ad es., privazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio di Zhang per la fornitura di stimolare discussioni e membri del laboratorio di Zhan per assistenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni 31500860 (a C.Z.) di NSFC, 2012CB837700 (per E.E.Z. e C.Z.) del programma 973 dal M.O.S.T. della Cina e da finanziamenti dal governo municipale di Pechino. E.E.Z. è stato sostenuto dai cinesi “Programma di reclutamento di esperti di gioventù globale”.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
