Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링
Summary
이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.
Abstract
이 기술을 기반으로 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 유전자 기자 들의 정확한 납품 광섬유 중재 형광 녹음을 결합합니다. 이 새로운 및 사용 하기 쉬운 vivo에서 형광 모니터링 시스템 개발 되었다 자유롭게 마우스를 이동의 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 시계 유전자, Cry1의 transcriptional 리듬을 기록 하. 이렇게 하려면, Cry1 전사 형광 기자 설계와 Adeno 관련 바이러스로 포장. 정제, 집중 바이러스 SCN 광케이블은 두뇌의 표면에 고정 후 삽입 하 여 다음 마우스에 주입 했다. 동물 자신의 집 새를 반환 하 고 충분 한 기자 식 되도록 1 개월 수술 회복 기간을 허용 했다. 형광 다음 자유롭게는 vivo에서 우리의 기관에서 만들어진 시스템 모니터링을 통해 마우스를 이동에 기록 되었다. 대 한 vivo에서 녹화 시스템, 488 nm 레이저는 동등한 힘의 4 개의 레이저 구동 출력으로 빛을 분할 한 1 × 4 빔-스플리터와 결합 했다. 이 설치 프로그램 4 동물에서 동시에 레코드를 사용할 수 있습니다. 각 내보낸된 형광 신호 광 전 증폭 관 관 및 데이터 수집 카드 통해 수집 되었다. 반면 이전 생물 발광 vivo에서 circadian 시계 기록 기술,이 형광에서 vivo에서 녹화 시스템 허용 빛 주기 circadian 시계 유전자 발현의 기록.
Introduction
포유류에서 suprachiasmatic 핵 (SCN) 외 인 환경 변화 (예를 들면, 빛, 온도, 스트레스, 등)1개인의 응답을 조정 전체 신체의 circadian 리듬을 제어 합니다. 코어 클록 구성 요소 Per1-3, Cry1 2, Clock, Bmal1의 구성 하 고 각 셀의 circadian clock을 조절에 중추적인 역할. 각 셀은 SCN에 transcriptional 활성 제, 시계/BMAL1, 당의 표현을 유도에 heterodimer 역할 포함 및 외침. 당 / 울 복잡 한 다음 시계/BMAL1 완료2,3약 24 h는 녹음 방송 번역 피드백 루프를 형성 하기의 기능을 억제.
이전 연구는 SCN에 비보 전 SCN 슬라이스 문화 방법4,,56 주로 고용 하 고, 한계가 우리의 능력을 저해는 동안이 접근은 귀중 한 정보를 제공 하 고, SCN에 다른 뇌 핵의 영향 뿐만 아니라이 중요 한 영역에 있는 셀에 외 인 자극 (예를 들면, 빛)의 효과 대 한 데이터를 가져옵니다. 2001 년에, 히토시 오카무라의 그룹 자유롭게 이동 마우스7에서 SCN에 vivo에서 모니터 circadian 시계 유전자 발현을 생물 발광 시스템을 사용 하는 첫번째 이었다. 켄 이치 혼 마의 그룹은 지난 몇 년 동안에는 생물 발광에서 vivo에서 SCN8,,910녹화 시스템 개발 지출 했습니다. 함께, 이러한 연구는 지속적인 암흑 또는 빛 펄스 후 circadian 시계를 모니터링 하는 기능 연구를 제공 합니다. 그러나, 때문에 생물 발광 너무 희미 한 명암 주기 동안 지속적인 모니터링 사실 빛 circadian 시계11, SCN 중재 진입에 필요한 주된 신호 함께 있도록입니다. 생물 발광 녹화와 관련 된 한계를 극복 하는 실험 방법의 개발에 대 한 수요 증가. 현재 보고서는 circadian 시계는 SCN에서 vivo에서 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 모니터링을 건립 되었다 형광 기반 시스템을 설명 합니다. 이 사용 하기 쉬운 메서드 명암 주기 동안 지속적인 모니터링을 허용 하 고 실시간 및 높은 시간 해상도에서 SCN에 circadian 시계 유전자의 녹음 방송의 장기 관찰에 대 한 허용.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo 방법, 동물 살해는 요구, 슬라이스 문화4,5, RT-PCR16, 제자리 교 잡17, 등 달리는 vivo에서 메서드를 기록 수 있습니다. 살아있는 동물에 circadian 유전자 발현 연구 조사. 따라서,이 기술은 신경 circadian 시계에 다른 물리적 섭 (예를 들어, 수 면 부족, 스트레스, 음식 섭취, 등)의 효과 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원을 제공 하기 위한 자극 토론 및 Zhan 연구소에서 회원을 제공 하기 위한 장 연구소에서 회원을 감사 합니다. 이 연구는 NSFC, 중국의 M.O.S.T.에서 973 프로그램의 (E.E.Z. C.Z.)를 2012CB837700의 31500860 (C.Z.)를 부여 하 고 베이징 시 정부에서 자금에 의해 지원 되었다. E.E.Z.는 “채용 프로그램 글로벌 청소년 전문가” 중국 사람에 의해 지원 되었다.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
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