Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi
Summary
Bu yeni geliştirilmiş floresans tabanlı teknoloji uzun vadeli, suprachiasmatic çekirdeği (SCN) sirkadiyen saat genlerde transkripsiyonu gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte fareler serbestçe hareket izleme sağlar.
Abstract
Bu teknik aracılı fiber optik floresans kayıtları rekombinant adeno ilişkili virüs dayalı gen gazetecilere kesin teslim ile birleştirir. Bu yeni ve kullanımı kolay vivo içinde floresans izleme sistemi saat gene, Cry1, transkripsiyon ritmine fareler serbestçe hareket suprachiasmatic çekirdeğinde (SCN) kaydetmek için geliştirilmiştir. Bunu yapmak için bir Cry1 transkripsiyon floresans muhabir tasarlanmış ve Adeno ilişkili virüs paketlenmiş. Arıtılmış, konsantre virüs SCN (sahne) o zaman beynin yüzeyine tespit edildi bir optik kablo, ekleme ve ardından fare içine enjekte ettiler. Hayvanlar için ev onların kafes döndü ve bir 1 ay ameliyat sonrası iyileşme döneminde yeterli muhabir ifade emin olmak izin. Floresan sonra serbestçe fareler bir vivo içinde bizim kurum olarak inşa edilmiş sistem izleme yoluyla hareket kaydedildi. Kayıt sistemi içinde vivo için 488 nm lazer ile bir 1 × 4 ışın-kırık ışık eşit güç dört lazer uyarma çıkışları bölünmüş birleştiğinde. Bu kurulum bize aynı anda dört hayvanlardan kaydetmek etkin. Her biri verilmiş floresan sinyallerini bir photomultiplier tüp ve bir veri alma kartı toplanmıştır. Buna ek olarak önceki bioluminescence vivo içinde sirkadiyen saat kayıt tekniği için kayıt sistemi bu floresans in vivo sirkadiyen saat gen ekspresyonu ışık döngüsü sırasında kayıt izin.
Introduction
Memelilerde, bütün vücudun sirkadiyen ritim eksojen çevresel değişiklikler (Örneğin, ışık, sıcaklık, stres, vb)1bir kişinin yanıt koordine etmek suprachiasmatic çekirdeği (SCN) yönetir. Çekirdek saat bileşenleri Per1-3, Cry1-2, saatve Bmal1oluşur ve her hücrenin sirkadiyen saat düzenleyen merkezi bir rol oynamaktadır. Transkripsiyon harekete geçirmek, saat/BMAL1, başına ifade ikna etmek için heterodimerdir davranan SCN her hücrede ve CRY. PER / CRY karmaşık sonra 24 saat tam2,3‘ e alır bir transkripsiyon çeviri geri besleme döngüsü oluşturmak için saat/BMAL1 işlevini engeller.
SCN önceki çalışmaları esas olarak ex vivo SCN dilim kültür Yöntem4,5,6 istihdam ve bu yaklaşım değerli bilgileri sağlamış olması iken, kendi sınırlamaları yeteneğimizi inhibe eksojen uyaranlara (Örneğin, ışık) etkisi kritik bu bölgede ikamet eden hücrelerin yanı sıra diğer beyin çekirdekleri SCN üzerinde etkisi ile ilgili verileri alır. 2001 yılında Hitoshi Okamura’nın grup içinde vivo monitör sirkadiyen saat gen ekspresyonu bioluminescence sisteme serbestçe fare7hareketli SCN (sahne) kullanmak için ilkti. Ken-Ichi Honma’nın grup daha fazla kayıt sistemi SCN (sahne)8‘,9,10bioluminescence vivo içinde gelişmekte olan son birkaç yıl harcadı. Birlikte, bu çalışmalarda araştırmacılar ile sirkadiyen saat sürekli karanlık veya ışık nabız sonra izleme olanağı sağladı. Ancak, bioluminescence sürekli açık/koyu döngüsü sırasında ışık sirkadiyen saat11, SCN-aracılı sürüklenme için gerekli baskın sinyal olması ile birleştiğinde izlenmesi için izin vermek için çok karanlık olduğu için yoktur bioluminescence kayıt ile ilgili sınırlamalar üstesinden deneysel Yöntem geliştirme için artan talebi. Geçerli raporu fareler serbestçe hareket SCN vivo içinde sirkadiyen saat izlemek için inşa edilmiş bir floresan tabanlı sistem açıklar. Bu kullanımı kolay yöntem sürekli açık/koyu döngüsü sırasında izleme izin verir ve gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte SCN sirkadiyen saat genlerin transkripsiyon uzun vadeli gözlenmesi için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dilim kültür4,5, RT-PCR16ve in situ hibridizasyon17, hayvanların öldürülmesi gerektiren gibi ex vivo Yöntemler aksine kayıt yöntemi içinde vivo sağlar Müfettişler sirkadiyen gen ekspresyonu yaşayan hayvan çalışmaya. Bu nedenle, bu teknoloji farklı fiziksel tedirginlikler (Örneğin, uykusuzluk, stres, gıda alımı, vb) sinir sirkadiyen saat üzerinde et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik yardım sağlamak için uyarıcı tartışmalar ve Üyeler Zhan laboratuarında sağlamak için Zhang laboratuarında üye teşekkür. Bu araştırma hibe NSFC, Çin ‘ in M.O.S.T. üzerinden 973 programının (için E.E.Z. ve C.Z.) 2012CB837700 31500860 (C.Z. için) ve Pekin Belediye hükümetten fon tarafından desteklenmiştir. E.E.Z. Çinliler “İşe alım programı küresel gençlik uzmanlar” tarafından desteklendi.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
