إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي
Summary
ويركز البروتوكول التالي على إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي (STS). هذا النموذج يمكن أن تساعدنا على فهم أفضل لخلفية الجزيئية والشخصية الدوائية لهذه الأورام الخبيثة النادرة، ويمكن أن تمثل نقطة انطلاق لإجراء مزيد من البحوث التي تهدف إلى تحسين إدارة STS.
Abstract
الأنسجة اللينة الطويلا (STS) تمثل طائفة من الأورام الخبيثة غير متجانسة مع صعوبة التشخيص والتصنيف، والإدارة. حتى الآن، تم التعرف على أنواع فرعية غذائها أكثر من 50 من هذه الأورام الصلبة نادرة. وهكذا، نظراً لتنوع استثنائي وانخفاض معدل الإصابة، فهمنا لعلم الأحياء من هذه الأورام لا يزال محدودا. وتمثل الثقافات المستمدة من المريض منصة مثالية لدراسة STS الفيزيولوجيا المرضية والصيدلة. وهكذا وضعنا نموذجا الإكلينيكية بشرية من STS بدءاً من عينات الورم حصادها من المرضى الذين يخضعون للاستئصال الجراحي. التي تم الحصول عليها من العينات الجراحية بالهضم كولاجيناز الثقافات الخلية STS المستمدة من المريض ومعزولة عن طريق الترشيح. كانت عد الخلايا والمصنف، وترك لمدة 14 يوما في ثقافات أحادي الطبقة القياسية وثم معالجتها بواسطة تحليل المتلقين للمعلومات. قبل القيام بالتحليلات الجزيئية أو الصيدلانية، أكد إنشاء ثقافات STS الأولية عن طريق تقييم ميزات سيتومورفولوجيك، وعندما تكون متاحة، علامات المناعي. ويمثل هذا الأسلوب أداة مفيدة 1) لدراسة التاريخ الطبيعي لهذه الأورام الخبيثة استكشفت سيئة و 2) لاختبار تأثيرات العقاقير المختلفة في محاولة لمعرفة المزيد عن تلك آليات العمل.
Introduction
الطويلا الأنسجة الرخوة (STS) وتشمل طائفة آفات غير متجانسة من أصل الوسيطة في حساب 1% من جميع الأورام الصلبة1،2، وتصنيف “منظمة الصحة العالمية” الجديدة تقر بوجود أكثر من 50 3من أنواع فرعية مختلفة. ومن بين هذه هيستوتيبيس الأكثر شيوعاً هي ساركومه adipocyte أو ليبوساركوما و leiomyosarcoma، تستأثر ب 15 في المائة و 11 في المائة من جميع البالغين STS، على التوالي4،5. على الرغم من أن يمكن تطوير STS في أجزاء مختلفة من الجسم، بالحدود القصوى و retroperitoneum هي المواقع الأكثر شيوعاً، والتي تحدث في 60% و 20% من الحالات، على التوالي6.
هو حجر الزاوية في علاج المرض المترجمة الاستئصال الجراحي على نطاق واسع، بينما فوائد العلاج الكيميائي adjuvant ونيوادجوفانت لا تزال غير واضحة، وتعتبر فقط في حالات مختارة7. في إعداد المنتشر، العلاج الكيميائي هو معيار العناية، لكن يظهر نتائج محدودة8. فهم أفضل للبيولوجيا الجزيئية من STS سيساعد على تحسين التشخيص التفضيلية الحالية وتحسين العلاجات المتاحة، وتحديد أهداف جديدة للعلاج.
وقد أجريت بحوث السرطان داخل هذا السياق، لسنوات عديدة باستخدام خلية مخلدة خطوط9. هي عادة مثقف في أحادي الطبقة قياسي يدعم هذه النماذج التجريبية أو مزروع في القوارض العوز إلى إنشاء نماذج في فيفو إكسينوجرافت10. تمثل الخطوط خلية مخلدة يمكن التحكم فيها وسهلة لتخزين مواد التي يمكن أن يؤديها على عدد كاف من تجارب بحثية. هي، في الواقع، الأقل كلفة والأكثر استخداماً أداة في الدراسات الإكلينيكية11.
ومع ذلك، نماذج سرطان الخلية-خط أساس لها أيضا بعض القيود والثقافة مثلاً لفترات طويلة في ظل نظام أحادي الطبقة جنبا إلى جنب مع عدد متزايد من الممرات يستحث المظهرية والانجراف الجينية، صنع خلايا أقل احتمالاً أن الخص الورم الرئيسية ميزات. وعلاوة على ذلك، تفشل الثقافات خط الخلية لإنتاج خلية إلى التفاعل والحديث المتبادل جزيء مما يشير إلى أن تقليد السلوك البيولوجي للأورام وتميز وورم المكروية. هذه القضايا تشكل الأساس للفجوة القائمة بين النتائج السريرية والاكلينيكية12.
وفي ضوء ما ورد أعلاه، ازداد الاهتمام بالثقافات الأولية المستمدة من المريض13. في الواقع، ختان الأنسجة الخبيثة والعادي يقلل من خطر فقدان سرطان الخلية النمط الظاهري وعدم التجانس، مما يتيح انطلاق المواد التي أكثر تمثيلاً لورم المكروية. وعلاوة على ذلك، استخدام عينات الورم الطازجة المحصودة من المرضى الذين يخضعون للعمليات الجراحية استئصال يتيح لنا للتحقيق في واحد من الأورام ومقارنة آفات مختلفة من نفس الجزء من جسم المريض14. للأسباب المذكورة أعلاه، تقدم الثقافات الخلية المستمدة من الأنسجة مادة قيمة لدراسة الأورام الفيزيولوجيا المرضية والصيدلة15،16،17، لا سيما في STS في خطوط الخلايا ساركومه المتاحة تجارياً التي هي محدودة18. وبالتالي نحن الأمثل طريقة لإنشاء ثقافة خلية الابتدائية STS المستمدة من المريض بدءاً من الورم جراحيا قصت الأنسجة13،،من1920. لدينا أسلوب يتكون من تصنيف الورم العينة إلى أجزاء صغيرة من أنسجة متبوعاً بتفكك النسيج الانزيمية بين عشية وضحاها الحصول على تعليق خلية مفردة. في اليوم التالي، توقفت عملية الهضم الأنزيمي بإضافة وسائل الإعلام ثقافة جديدة وتعليق التي تم الحصول عليها تم تصفيته لإزالة شظايا الأنسجة والخلية-المجاميع، والمواد الزائدة المصفوفة أو الحطام. وأخيراً، جزء خلايا السرطانية المعزولة سيتوسبينيد على الشرائح الزجاجية، ثابتة وتخزينها لتحليل المتلقين للمعلومات الرامية إلى تأكيد إنشاء ثقافة STS الأولية سيتومورفولوجيكال والمناعي والتقييم الخلوية الوراثية الجزيئية (مثل السمك في تحليل التضخيم MDM2 يمثل تشخيص التفاضلية القياسية ليبوساركوما جيدا متمايزة وليبوساركوما ديديفيرينتياتيد) 4-الخلايا المتبقية هي المصنفة إلى ثقافة أحادي الطبقة قياسية للدراسات التنميط والدوائي التعبير الجيني. جميع التجارب التي تتم باستخدام منخفض ممر الثقافات الأولية لتجنب اختيار سوبكلونيس السرطان محددة، وتحليلها من قبل الطبيب الشرعي ساركومه ذوي خبرة. وهكذا أنشأنا بشرية الكامل STS السابقين فيفو نموذج13،،من1920. هذا تنوعاً عاليا، وسهلة للتعامل مع نموذج يمكن أن يمثل أداة مفيدة لأنواع مختلفة من البحوث الإكلينيكية، مثل تحديد واسمات جزيئية جديدة للتشخيص والتشخيص أو للحصول على فهم أعمق لنشاط وآليات عمل موحدة وجديدة من العقاقير المستخدمة في إدارة STS.
Protocol
Representative Results
Discussion
نماذج محددة تحديداً جيدا السريرية ضرورية لتوضيح الخلفية الجزيئية للأورام، والتنبؤ بسوء التشخيص، وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لمرضى السرطان. هذا مهم بشكل خاص لاورام نادرة مثل STS التي تغاير عالية من حيث التشكل، والسلوك العدواني المحتملة، والسريرية التحديات فهمنا للبيولوجيا STS وإدارة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر تيرني Gráinne للمساعدة التحريرية.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours – an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
