Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen
Summary
Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen (STS). Dieses Modell könnte uns helfen, besser zu verstehen, die molekularen Hintergründe und pharmakologischen Profil von diesen seltenen Tumoren und könnte einen Ausgangspunkt für die weitere Forschung zur Verbesserung der STS Management darstellen.
Abstract
Weichgewebe Sarkome (STS) decken ein Spektrum von heterogenen Tumoren mit einer schwierigen Diagnose, Klassifikation und Management. Bis heute wurden mehr als 50 histologische Subtypen dieser seltenen soliden Tumoren identifiziert. So ist unser Verständnis für die Biologie dieser Tumoren aufgrund ihrer außerordentlichen Vielfalt und niedrige Inzidenz, noch begrenzt. Patienten-abgeleiteten Kulturen repräsentieren die ideale Plattform, STS-Pathophysiologie und Pharmakologie zu studieren. Wir entwickelt somit ein menschliches Präklinisches Modell STS ab Tumor Proben von Patienten, die eine chirurgische Resektion geerntet. Patienten abgeleitet STS Zellkulturen wurden aus der chirurgischen Proben von Kollagenase Verdauung und isoliert durch Filtration. Zellen wurden gezählt, ausgesät, und Links für 14 Tage in standard Monolayer-Kulturen und dann durch nachgeschaltete Analyse verarbeitet. Bevor Sie Molekulare oder pharmazeutische Analysen durchführen, die Einrichtung von STS Primärkulturen wurde bestätigt durch die Evaluierung zytomorphologischen Merkmale und, wenn vorhanden, immunhistochemischen Marker. Diese Methode stellt ein nützliches Werkzeug (1), die Naturgeschichte dieser schlecht erforschten maligner Erkrankungen zu studieren und 2) so testen Sie die Auswirkungen von verschiedenen Drogen in einer Bemühung, mehr über ihre Wirkmechanismen zu erfahren.
Introduction
Weichgewebe Sarkome (STS) umfassen ein Spektrum von heterogenen Läsionen des mesenchymaler Herkunft einen Anteil von 1 % aller soliden Tumoren1,2, und die neue Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) erkennt das Vorhandensein von mehr als 50 Subtypen3. Unter diesen sind die am häufigsten verwendeten Histotypes Adipocyte Sarkom oder Liposarcoma und Leiomyosarcoma, einem Anteil von 15 % und 11 % aller Erwachsenen m., jeweils4,5. Obwohl STS in verschiedenen Teilen des Körpers entwickeln können, sind die Extremitäten und Retroperitoneum die häufigsten Lokalisationen, in 60 % und 20 % der Fälle, bzw.6auftreten.
Die Eckpfeiler der Therapie für die lokalisierten Krankheit ist Breite chirurgische Resektion, während die Vorteile der adjuvanten und neoadjuvanten Chemotherapie noch unklar sind und nur in ausgewählten Fällen7 gelten. In der metastasierten Einstellung Chemotherapie ist die Standardbehandlung zeigt aber begrenzte Ergebnisse8. Ein besseres Verständnis der molekularen Biologie der STS würde dazu beitragen, verbessern die aktuellen Differentialdiagnose, die verfügbaren Behandlungen zu optimieren und neue Ziele für die Therapie zu identifizieren.
In diesem Zusammenhang wurde die Krebsforschung seit vielen Jahren mit verewigt Zelle Linien9durchgeführt. Diese experimentelle Modelle sind normalerweise in standard Monolage unterstützt kultiviert oder eingepflanzt immungeschwächte Nagetiere, in Vivo Xenograft10Modelle zu etablieren. Immortalisierte Zelllinien repräsentieren eine überschaubare und einfach zu speichern Material, mit der zahlreiche Forschung Experimente durchgeführt werden kann. Sie sind in der Tat, die am wenigsten teuer und am weitesten verbreitete Tool in präklinischen Studien11.
Jedoch Zelllinie basierte Krebs Modelle haben auch einige Einschränkungen, z.B. verlängerte Kultur in einem Monolayer-System zusammen mit einer zunehmenden Anzahl von Passagen induziert phänotypischen und Gendrift, machen Zellen weniger wahrscheinlich zu wichtigen Tumor rekapitulieren Funktionen. Darüber hinaus fehl Linie Zellkulturen, die Zell-Zell-Interaktion und Signalisierung Molekül Übersprechen, die das biologische Verhalten von Tumoren zu imitieren und zu charakterisieren, der Tumor Mikroumgebung zu reproduzieren. Diese Fragen bilden die Grundlage des Spaltes zwischen präklinischer und klinischer Ergebnisse12.
Angesichts des oben genannten, stieg das Interesse an Patienten abgeleitet Primärkulturen13. In der Tat reduziert die Exzision von bösartigen und normalen Gewebe das Risiko von Krebs Zelle Phänotyp und Heterogenität, bietet somit Ausgangsmaterial, die repräsentativ für die Tumor-Mikroumgebung zu verlieren. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von frischen Tumor Proben von Patienten, die eine chirurgische Resektion geerntet uns einzelne Tumoren untersuchen und vergleichen Sie verschiedene Läsionen aus dem gleichen Teil des Patienten Körper14. Aus den genannten Gründen Gewebe abgeleitet Zellkulturen zur Verfügung stellen eines wertvollen Materials um Tumor Pathophysiologie und Pharmakologie15,16,17, vor allem im STS in die im Handel erhältlichen Sarkom-Zelllinien zu studieren sind nur18. Wir optimieren damit eine Methode, um einen Patienten abgeleitet STS Primärzelle ab chirurgisch besteuerte Tumor Gewebe13,19,20zu etablieren. Unsere Methode besteht aus disaggregieren der Tumor-Probe in kleinen gewebefragmente gefolgt von Übernachtung enzymatische Gewebe Dissoziation, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Am nächsten Tag die enzymatische Verdauung wird durch Zugabe von frischen Nährmedien gestoppt und die erhaltene Suspension wird gefiltert, um gewebefragmente, Zelle-Aggregate und überschüssige Matrixmaterial oder Fremdkörper zu entfernen. Zu guter Letzt ist ein Bruchteil von isolierten Tumorzellen Cytospinned auf Objektträger fixiert und für nachgelagerte Analyse bestätigt die Gründung des STS Primärkultur abzielen, durch zytomorphologischen, immunhistochemische und molekularen zytogenetische Auswertung gespeichert (z.B. FISH-Analyse von MDM2 Verstärkung steht für den standard Differentialdiagnose für eine gut differenzierte Liposarcoma und dedifferentiated Liposarcoma) 4. die verbleibenden Zellen in eine standard Monolayer Kultur für profiling und pharmakologischen genexpressionsstudien ausgesät werden. Alles, was die Experimente durchgeführt werden mit niedrigen Durchgang Primärkulturen, die Auswahl der spezifischen Krebs-Subclones zu vermeiden und durch einen erfahrenen Sarkom Pathologen analysiert. Damit haben wir ein vollständig humaner STS Ex-Vivo Modell13,19,20geschaffen. Dieser vielseitig, einfach zu Griff Modell könnte ein nützliches Werkzeug für verschiedene Arten von präklinischen Forschung, z.B. um neue molekulare Marker für die Diagnose und Prognose zu identifizieren oder um ein tieferes Verständnis für die Aktivität und Mechanismen zu gewinnen stellen Wirkung von Standard- und neue Medikamente bei der Verwaltung von STS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gut definierte präklinische Modellen genügen, um den molekularen Hintergrund von Tumoren zu erhellen, schlechten Prognose Vorhersagen und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, für Krebspatienten. Dies ist besonders wichtig für seltene Tumoren wie STS, deren hohe Heterogenität in Bezug auf die Morphologie, aggressives Potenzial und klinischen Verhalten fordert unser Verständnis von STS-Biologie und Patientenmanagement21. Darüber hinaus einige kommerzielle Sarkom-Zell-Linien zur Verf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Gráinne Tierney für redaktionelle Unterstützung bedanken.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
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