Etablering av en primære kultur for pasient-avledede bløtvev sarkom
Summary
Følgende protokollen fokuserer på etableringen av en primære kultur for pasient-avledede bløtvev sarkomspesialitet (m). Denne modellen kan hjelpe oss å forstå molekylær bakgrunnen og farmakologiske profil av disse sjeldne malignitet og kan representere et utgangspunkt for videre forskning å bedre STS ledelse.
Abstract
Bløtvev sarkomer (m) representerer et spekter av heterogene malignitet med en vanskelig diagnose, klassifisering og management. Hittil har mer enn 50 histologiske undergrupper av disse sjeldne solide tumorer blitt identifisert. Dermed sine ekstraordinære mangfold og lav forekomst er vår forståelse av disse svulstene biologi fortsatt begrenset. Pasient-avledede kulturer representerer den ideelle plattformen STS patofysiologi og farmakologi. Vi utviklet dermed menneskelige prekliniske modell m fra svulst prøver høstet fra pasienter som gjennomgår kirurgisk resection. Pasient-avledede STS cellekulturer var Hentet fra den kirurgiske prøver av collagenase fordøyelse og isolert av filtrering. Cellene ble regnet, seeded, og igjen i 14 dager i standard monolayer kulturer og deretter behandlet av nedstrøms. Før du utfører molekylære eller farmasøytiske analyser, etablering av STS primære kulturer ble bekreftet gjennom evalueringen av cytomorphologic funksjoner og, når immunohistochemical markører. Denne metoden representerer en nyttig verktøyet 1) for å studere den naturlige historien disse dårlig utforsket malignitet og 2) for å teste effekten av ulike å lære mer om deres virkningsmekanismer.
Introduction
Bløtvev sarkomer (m) inkluderer et spekter av heterogene lesjoner av mesenchymal opprinnelse 1% av alle solide svulster1,2, og den nye Verdens helseorganisasjon klassifiseringen gjenkjenner tilstedeværelsen av mer enn 50 forskjellige subtyper3. Blant disse er de vanligste histotypes adipocyte sarkom eller liposarcoma og leiomyosarcoma, sto for 15% og 11% av alle voksne m, henholdsvis4,5. Selv om STS kan utvikle i ulike deler av kroppen, er armer og retroperitoneum de vanligste stedene, forekommer i 60% og 20% av tilfellene, henholdsvis6.
Hjørnesteinen i terapi for lokalisert sykdom er bredt kirurgisk resection, mens fordelene med adjuvant og neoadjuvant kjemoterapi er fortsatt uklart og regnes kun i Utvalgte tilfeller7. I innstillingen metastatisk kjemoterapi er standarden på omsorg, men viser begrensede resultater8. En bedre forståelse av molekylærbiologi m vil bidra til å forbedre det gjeldende differensialdiagnose, optimalisere tilgjengelige behandlingene og identifisere nye mål for terapi.
I denne sammenheng, er forskning på kreft utført i mange år med udødeliggjort cellen linjer9. Disse eksperimentelle modeller er vanligvis kultivert i standard monolayer støtter eller implantert i immunodeficient gnagere å etablere i vivo xenograft modeller10. Udødeliggjort cellelinjer representerer et håndterlig og lett til store materiale som et stort antall forskning eksperimenter kan utføres. De er faktisk den rimeligste og mest brukt verktøyet i preklinisk studier11.
Imidlertid celle basert kreft modeller har også noen begrensninger, f.eks langvarig kultur i et monolayer system med et økende antall passeringer induserer fenotypiske og genetiske drift, gjør cellene mindre sannsynlig for å recapitulate nøkkel svulst funksjoner. Videre linje cellekulturer ikke reprodusere celle til celle samhandling og signalnettverk molekyl crosstalk som etterligner biologisk atferd av svulster og karakterisere svulst microenvironment. Disse problemene danner grunnlaget for gapet mellom prekliniske og kliniske resultater12eksisterende.
Gitt ovenfor, har interessen for pasient-avledede primære kulturer økt13. Faktisk reduserer eksisjon av ondsinnethet og normalt vev risikoen for å miste kreft cellen fenotypen og heterogenitet, dermed tilby utgangsmaterialet som er mer representativt for svulst microenvironment. Videre kan bruk av fersk svulst høstet fra pasienter som gjennomgår kirurgisk resection vi undersøke enkelt svulster og sammenligne ulike lesjoner fra samme del av pasientens kropp14. Av ovennevnte årsaker gir vev-avledet cellekulturer et verdifullt materiale for å studere svulst patofysiologi og farmakologi15,16,17, spesielt i m som kommersielt tilgjengelig sarkomspesialitet linjer er begrenset18. Vi dermed optimalisert en metode for å etablere en pasient-avledede STS primære cellekultur fra inngrep forbrukeravgift svulst vev13,19,20. Våre metoden består av disaggregating svulst prøven i liten vev fragmenter etterfulgt av natten enzymatisk vev dissosiasjon å få en enkeltcelle suspensjon. Dagen enzymatisk fordøyelsen stoppes ved å legge friske kultur medier og fått suspensjon er filtrert for å fjerne vev fragmenter, celle-aggregat, og overflødig matrix materiale eller rusk. Til slutt, en brøkdel av isolerte kreftceller er cytospinned på glass lysbilder, fast og lagret for nedstrøms analyse rettet mot bekrefter etableringen av STS primære kultur av cytomorphological, immunohistochemical og molekylære cytogenetic evaluering (f.eks fisk analyse av MDM2 forsterkning representerer den standard differensialdiagnose for et godt differensiert liposarcoma og den dedifferentiated liposarcoma) 4. de gjenværende cellene er sådd i en standard monolayer kultur for gene expression profilering og farmakologiske studier. Alle eksperimenter utføres ved hjelp av lav passasje primære kulturer å unngå valg av bestemte kreft subclones og analyseres av en erfaren sarkomspesialitet patolog. Dermed har vi laget en fullstendig menneske STS ex-vivo modell13,19,20. Denne allsidige, lett å håndtere modell kan representere et nyttig verktøy for ulike typer prekliniske forskning, f.eks å identifisere nye molekylære markører for diagnose og prognosen eller å få en dypere forståelse av aktiviteten og mekanismer handlingen av standard og nye legemidler som brukes i forvaltningen av m.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veldefinert prekliniske modeller for å belyse molekylær bakgrunnen av svulster forutsi dårlig prognose og utvikle nye strategier for kreftpasienter. Dette er spesielt viktig for sjeldne svulster STS som høy heterogenitet i morfologi, aggressiv potensial, og kliniske atferd utfordringer vår forståelse av STS biologi og pasient ledelse21. Videre de få kommersielle sarkomspesialitet celle linjene tilgjengelig begrenser prekliniske undersøkelser i denne gruppen av mesenchymal svulster<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Gráinne Tierney for redaksjonell bistand.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours – an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
