अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक पता लगाने के प्रोटीन और उनके Isoforms द्वारा केशिका Isoelectric ध्यान केंद्रित विधि
Summary
केशिका isoelectric फोकस एक एंटीबॉडी आधारित, ultrasensitive, उच्च प्रवाह तकनीक है, अत्यंत छोटे जैविक नमूनों से प्रोटीन और उनके isoforms के विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करने से । निम्नलिखित एक स्वचालित और रोबोट तरीके से विशिष्ट प्रोटीन और उनके isoforms का पता लगाने और ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।
Abstract
Immunoblotting जैविक नमूनों से प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए कई प्रयोगशालाओं में एक नियमित तकनीक बन गया है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है, केशिका isoelectric ध्यान केंद्रित (cIEF), पारंपरिक immunoblotting की तुलना में कई फायदे के साथ. यह एक एंटीबॉडी आधारित, स्वचालित, तेजी से, और मात्रात्मक विधि जिसमें एक पूरा पश्चिमी सोख्ता प्रक्रिया एक ultrathin केशिका के अंदर जगह लेता है । इस तकनीक को एक झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए जेल की आवश्यकता नहीं है, दाग के अलग करना, या एक्स-रे फिल्मों, जो आम तौर पर पारंपरिक immunoblotting के लिए आवश्यक हैं । यहां, प्रोटीन उनके चार्ज (isoelectric बिंदु; pI), कुल प्रोटीन lysate के एक microliter (४०० nL) से कम का उपयोग कर के अनुसार अलग कर रहे हैं । ट्रो के बाद, प्रोटीन पराबैंगनी प्रकाश उपचार द्वारा केशिका दीवारों पर स्थिर कर रहे हैं, प्राथमिक और माध्यमिक (सहिजन peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित) एंटीबॉडी की मशीन, जिसका बंधन बढ़ाया के माध्यम से पता चला है द्वारा पीछा किया chemiluminescence (ECL), एक प्रकाश संकेत है कि कब्जा कर लिया जा सकता है और एक चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा द्वारा दर्ज उत्पादन । डिजिटल छवि और विश्लेषण किया जा सकता है quantified (पीक क्षेत्र) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । इस उच्च प्रवाह प्रक्रिया एक समय में ९६ नमूने संभाल कर सकते हैं; अत्यधिक संवेदनशील है, picogram रेंज में प्रोटीन का पता लगाने के साथ; और स्वचालन के कारण अत्यधिक reproducible परिणाम पैदा करता है । इन पहलुओं के सभी अत्यंत मूल्यवान है जब नमूनों की मात्रा (जैसे, ऊतक के नमूनों और बायोप्सी) एक सीमित कारक है । तकनीक व्यापक अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से, दवाओं या एंटीबॉडी, unmarker खोज, और नैदानिक प्रयोजनों के स्क्रीनिंग सहित है ।
Introduction
केशिका isoelectric (cIEF) एक स्वचालित, केशिका आधारित immunoassay है जो अपने चार्ज1,2,3के आधार पर प्रोटीन को हल करता है । यह अत्यधिक reproducible और प्रोटीन का समाधान करने में सक्षम है और उनके पद-अनुवाद संशोधित isoforms तेजी से और मात्रात्मक । यह पश्चिमी सोख्ता के रूप में पारंपरिक तरीकों के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करता है । जबकि पश्चिमी सोख्ता आसानी से सुलभ नमूनों में प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए बहुत अच्छा है; परिवर्तनशीलता, समय की खपत, और सटीक quantitation सभी वर्तमान चुनौतियों, विशेष रूप से जब जैविक ऊतक नमूनों की जांच । वास्तव में, परिवर्तनशीलता पश्चिमी सोख्ता में एक अंतर्निहित समस्या है, के रूप में वहाँ कई कदम शामिल हैं, इस तरह के लोड हो रहा है और एसडीएस के चलने के रूप में-पृष्ठ जैल, झिल्ली पर प्रोटीन का हस्तांतरण, विभिन्न रिएजेंट के साथ मशीन (जैसे, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, ECL), और विकास पर एक्स-रे फिल्म4. वर्तमान में, पश्चिमी सोख्ता तकनीक chemiluminescent संकेतों (डिजिटल पश्चिमी) के डिजिटल रिकॉर्डिंग के कार्यांवयन के साथ सुधार है । हाल ही में, एक स्वचालित पश्चिमी सोख्ता प्रणाली विकसित की गई है, अर्थात् केशिका पश्चिमी, जो एक अधिक हाथों से मुक्त और जेल मुक्त प्रणाली है । पूरे परख एक नमूना प्लेट की लोडिंग प्रणाली3,4में सभी आवश्यक रिएजेंट के साथ (नमूने) के बाद स्वचालित है । साधन प्रोटीन जुदाई के रूप में सभी कदम प्रदर्शन करेंगे, केशिका दीवार पर प्रोटीन के स्थिरीकरण, एंटीबॉडी की मशीन, विभिन्न चरणों के बीच बहाकर, और विकास और chemiluminescent संकेतों के ठहराव. इस प्रकार, cIEF प्रक्रिया यहां प्रस्तुत उच्च संकल्प और संवेदनशीलता प्रदान करता है ।
इस विधि संवेदनशील है, के रूप में संकेत उत्पन्न किया जा सकता है और प्रोटीन की picograms से quantified1. उत्कृष्ट reproducibility के साथ उच्च संवेदनशीलता इस प्रौद्योगिकी बहुत नैदानिक नमूनों के विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है । यह पता लगाने के साथ ही पोस्ट शोधों संशोधन (जैसे, प्रोटीन के विभिंन phosphorylated प्रोटीन isoforms) भेद कर सकते हैं । इस तकनीक को सफलतापूर्वक कैंसर3में नए चिकित्सकीय विकसित करने के लिए लक्ष्य नैदानिक अध्ययन में अलग संकेतन रास्ते4,5 काटना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह प्रोटीन के लिए महान क्षमता है, और दवा की खोज .
Protocol
Representative Results
Discussion
संवेदनशीलता और प्रोटीन के संकल्प जैविक नमूनों पर proteomic अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं । वहां महान मूल्य में प्रोटीन जो कोशिकाओं में मिनट मात्रा में मौजूद है का पता लगाने में सक्षम किया जा रहा है । cIEF प्रो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक धंयवाद प्रो लीना क्लैसन-वेल्श, उपसाला विश्वविद्यालय, इस परियोजना के विकास के लिए उसके समर्थन के लिए स्वीडन । इसके अतिरिक्त, लेखक धंयवाद रॉस स्मिथ और लीना क्लैसन-वेल्श, उपसाला विश्वविद्यालय उनके महत्वपूर्ण पढ़ने और सुझावों के लिए पांडुलिपि में सुधार के लिए ।
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
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