Summary
Капиллярного изоэлектрической фокусировки является метод на основе антител, сверхчувствительная, высокая пропускная способность, позволяя подробную характеристику белков и их изоформы биологических пробах крайне мала. Ниже описывается протокол для обнаружения и количественного определения специфических белков и их изоформы автоматизированные и роботизированные образом.
Abstract
Immunoblotting стала обычной техники во многих лабораториях для характеризации белка из биологических образцов. Следующий протокол предоставляет альтернативную стратегию, капиллярные изоэлектрической фокусировки (главный), с много преимуществ по сравнению с обычными immunoblotting. Это на основе антител, автоматизированных, быстрое и количественный метод, в котором полный западных blotting процедуры происходит внутри ультратонких капилляров. Этот метод не требует гель для передачи мембраны, зачистки помарки, или рентгеновские пленки, которые обычно требуются для обычных immunoblotting. Здесь, протеины разделены согласно их заряда (Изоэлектрическая точка; Пи), используя меньше, чем микролитр (400 nL) общего белка lysate. После электрофореза, белки являются иммобилизованных на стенки капилляров, ультрафиолетовый свет лечения, следуют первичный и вторичный (пероксидазы (ПХ) конъюгированных) Антитело инкубации, привязку которого обнаруживается через расширение Хемилюминесценция (ЭСЛ), создавая световой сигнал, который может быть захвачен и Записанная камерой зарядовой (связью ПЗС). Цифровые изображения могут быть проанализированы и количественно (площадь пика) с помощью программного обеспечения. Эта процедура высокая пропускная способность может обрабатывать 96 образцов одновременно; очень чувствительна, с обнаружением белка в диапазоне пикограмм; и производит высоко воспроизводимые результаты благодаря автоматизации. Все эти аспекты являются чрезвычайно ценными, когда количество образцов (например, образцы тканей и биопсии) является ограничивающим фактором. Методика имеет более широкое применение, включая скрининг наркотиков или антител, открытия биомаркеров и диагностических целей.
Introduction
Капиллярные изоэлектрической упором (главный) является автоматизированной, основанный на капиллярной иммуноанализ, устраняющее белков на основе их заряда1,2,3. Это очень воспроизводимость и способный разрешать белков и их post-translationally модифицированных изоформ быстро и количественно. Она представляет альтернативу обычные методы, такие как Западный blotting. В то время как Западный blotting очень хорошо для подтверждающих наличие обильные белков в легкодоступном образцов; изменчивость, время потребления и точный количественный всех присутствующих задач, в частности при рассмотрении образцы биологических тканей. Действительно, изменчивость присущие проблема в Западный blotting, как есть многочисленные шаги, связанные, например, загрузки и запуска гелях SDS-PAGE, перенос белков на мембраны, инкубации с различными реагентами (например., начальное и среднее антитела, ЭСЛ) и развитие на рентгеновской пленки4. В настоящее время западные blotting метод улучшается с осуществлением цифровой записи хемилюминесцентный сигналов (цифровой вестерны). Недавно автоматизированная система западных blotting был разработан, а именно капилляра Западной, которая является более свободные руки и гель свободной системы. Весь assay автоматически после загрузки образца пластины (образцы с всеми необходимыми реагентами) в системе3,4. Инструмент будет выполнять все шаги, такие, как разделение белков, иммобилизации белков на капиллярной стенки, инкубаций антитела, моет между различные шаги и развитием и количественная оценка хемилюминесцентный сигналов. Таким образом главный представленные здесь приведен выше разрешение и чувствительность.
Этот метод является чувствительной, как сигналы могут быть созданы и количественно от пикограмм1белки. Высокая чувствительность с отличную воспроизводимость делает эту технологию очень полезным для анализа клинических образцов. Он может обнаружить, а также отличить пост поступательные изменения (например, различные фосфорилированных белка изоформ) белков. Эта технология успешно используется для рассечения различных сигнальных путей4,5 , в клинических исследованиях, направленных на разработку новой терапии рака3, и он имеет большой потенциал для обнаружения белковых биомаркеров и наркотиков .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. клетки культуры, стимуляции и Lysis
Примечание: Этот метод может использоваться с многие типы клеток. Чтобы проиллюстрировать метод, описан пример использования человеческого пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs).
- Культура HUVECs на желатин покрытием, 10 см Петри в эндотелиальных клеток базального среде с соответствующих добавок (см. Таблицу материалы), а также содержащая 5% FCS, эпидермального фактора роста (5 нг/мл), Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF: 0,5 нг/мл), основные ФБП (10 нг/мл), инсулин подобный фактор роста (20 нг/мл), гидрокортизон (0,2 мкг/мл) и аскорбиновой кислоты (1 мкг/мл).
- Голодать клетки на ночь с эндотелиальных клеток базального среднего дополнена 1% FCS и не дополнение фактор роста.
- Аспирационная всех средних, добавить 2 мл питательной среды эндотелиальных клеток без роста факторов (голода средний) в одном блюде (управления), затем добавить 50 нг/мл VEGF в 2 мл питательной среды голода в второе блюдо за 7 мин.
- Аспирационная среднего и вымыть клетки 2 раза с 10 мл комнатной температуре PBS.
- Обеспечить Петри на льду и держать их там с этого года.
- Мкл 250-400 лед холодной лизис буфера (Bicine/CHAPS; см. Таблицу материалы) содержащий водный протеазы ингибитор смеси и смеси ДМСО ингибитора (битор фосфатазы; см. Таблицу материалы) для каждой пластины 10 см. Вихрем пластину для обеспечения надлежащего охвата и держать его на 10 мин на льду.
Примечание: Конечная концентрация протеазы и АБС битор смеси ДМСО должна быть 1 x. - Скрип клетки от блюдо с скребок клетки и передачи к трубке предварительно охлажденные отцентрифугировать. Пипетка вверх и вниз 5 раз, чтобы лизировать клетки.
- Кратко sonicate клетки на 4 ° C. Установите sonicator следующим образом: количество циклов = 5, мощность = низкий, = 5 сек, OFF = 30 s. Этот шаг входит перерыв нуклеиновые кислоты и не Лизируйте клетки.
Примечание: Sonication должна быть мягкой, чтобы избежать денатурации белков. - Вихревой трубе для 5 s (не постоянно), 2 s на время (3 раза) и держать на льду.
- Уточнить lysate центрифугированием в 14.000 x g 15 мин при температуре 4 ° C, а затем немедленно перевести супернатант в трубу чистой предварительно охлажденные отцентрифугировать.
- Измерьте концентрацию протеина, с помощью Bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного комплект4.
- Сделать 10 мкл аликвоты, оснастки заморозить в сухой лед или жидкий азот и хранить при температуре-80 ° C до использования.
2. Подготовка смеси (расчет за 150 мкл пример Mix)
- Во-первых, подготовить образец разбавителя смесь, добавив 1 мкл смеси ДМСО ингибитора (stock 50 x) и 2 мкл ингибиторов протеазы (сток 25 x) до 47 мкл пример разбавителя (см. Таблицу материалы), так что конечная концентрация ДМСО ингибиторы и ингибиторы протеазы становится 1 x. Затем разбавьте лизатов белка, используя образец смеси разбавителя для получения желаемой концентрации (см. шаг 2.3).
- Подготовьте смесь ингибитор ингибиторы протеазы/лестницы/ampholyte/ДМСО, добавив 3.325 мкл Стандартная лестница (см. Таблицу материалов; фондовый 60 x), 6 мкл ингибитора протеазы (25 x), 3 мкл ингибитора ДМСО (50 x) чтобы 137.675 мкл ampholyte премиксов (см. таблицы Материалы). Вихревой трубы по крайней мере 15 s всего, 5 s в то время (3 - 4 раза) и держать на льду.
- Смешать решения от шагов, 2.1 и 2.2 в соотношении 1:3, так что окончательный концентрации ДМСО, Ингибиторы протеаз и Стандартная лестница Пи стать 1 X, и белков в капилляр достичь окончательного желаемой концентрации (например, 50 мкг/мл был использован для Рисунок 2).
Примечание: Концентрация белка в капиллярной и хорошо совпадают. - Загрузить 10 мкл пример смеси в соответствующие колодец, согласно 384-ну пластины пробирного шаблон макета (см. шаг 3 и Диаграмма 1) и держать пластину на льду.
- Разбавить начальной (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) и вторичные антитела (1: 300) с антителом разбавителя (см. Таблицу материалы) и Пипетка 10 мкл первичных и 15 мкл вторичных антител в каждой скважине.
Примечание: В целом, более высокая концентрация антител необходимы для главный анализов по сравнению с обычными западной помарки. - Смешать Luminol и перекись XDR (соотношение 1:1; см. Таблицу материалы) вместе и Пипетка 15 мкл в каждой скважине.
Примечание: Смешать эти решения свежий каждый раз перед использованием и держите на льду. - После того, как образцы и все реагенты являются накапаны в пластину, центрифуга пластину на 2500 x g 10 мин при 4 ° C для спина вниз жидкости и удалить пузыри. Если пузыри все еще существует, удалите их вручную с помощью кончик тонкой пипеткой.
Примечание: Не загружайте более чем 20 мкл пример или реагентов в скважины; в противном случае инструмент Пипетка нельзя стирать должным образом. Убедитесь в том следовать инструкции от производителя подготовить все реагенты.
3. проектирование нового шаблона Assay с системного программного обеспечения (рис. 1)
- Откройте системного программного обеспечения и нажмите кнопку «Новый» из меню файл.
- Перейдите к панели макета и назначение места для реагенты и образцы в 384 хорошо плиты. Использовать до максимум 96 скважин на 384-ну пластину.
- Сделайте назначения реагента, щелкнув хорошо везде в блоке. Выберите строку блока 12 скважин. Уэллс, например, от 1-12 или 13-24, назначаются в качестве блока по умолчанию.
- Перейдите к панели инструментов Макет панели и вставьте либо пустую строку или образца, начальных, средних либо luminol строки блок. Каждый блок присваивается другой цвет, поэтому они легко отличить.
Примечание: При нажатии колодец, черную границу можно увидеть вокруг блока, где новый блок будет вставлен в панели. Можно также удалить строку блока. - Перейдите к панели протокол и выберите местоположение реагента в пластине. Затем щелкните ячейку в столбце образца и выберите реагента в раскрывающемся меню.
- Таким же образом выберите расположение реагент для начального, среднего и luminol для каждого цикла.
- Щелкните ячейки, один момент, в столбце первичного или вторичного антитела и при необходимости измените время инкубации.
Примечание: Запись примечания для каждого цикла также могут быть добавлены. - Добавление циклов, нажав кнопку «Добавить» в разделе протокол. 1 цикл, 4 циклов или все циклы (максимум 8 циклов могут быть добавлены к протоколу).
Примечание: Это можно скопировать и Вставить цикл информации в этот шаг: выберите цикл, перейдите к редактировать, копировать и вставлять. - Введите информацию, относящуюся к образцу, таких как личность первичных и вторичных антител, их номера каталога и разведения, и т.д., на панели шаблон. Это необязательный шаг, который полезен во время после выполнения анализа.
- Сохраните новый файл assay. Перед нажатием кнопки «Пуск», быстро проверьте макет, чтобы убедиться, что все правильно.
4. протокол для главный инструмент настройки
- Установите капиллярного электрофореза изоэлектрической фокусировки условий разделения. Они должны быть 15000 мкВт и 40 мин, и УФ иммобилизации время должно быть 80 s. Однако время иммобилизации УФ может устанавливаться в пределах 80-140 s и может потребоваться быть оптимизированы для протеина интереса.
Примечание: Время точкой для УФ иммобилизации можно задать для каждого цикла, но не для каждого капилляра. - Набор мыть моет 1 до 2, 150 s каждый мыть (по умолчанию) и основное антитело инкубации для 120 мин.
- Набор мыть моет 2 до 2, 150 s каждый мыть (по умолчанию) и вторичное антитело инкубации 60 мин.
- Установка мытье 3, которая должна быть 2 моет, 150 s каждый мыть (по умолчанию).
- Задать время экспозиции, когда будет обнаружено хемилюминесценции; они должны быть, 30, 60, 120, 240, 490 и 960 s. Все шаги (1-8) будет осуществляться в один капилляр.
5. Запуск файла Assay
- Как только все будет готово, нажмите кнопку Пуск для начала выполнения. Программа предложит вам удалить отходы, для пополнения воды и поле капилляров, чтобы добавить католит и анолит ресурсов лоток, чтобы добавить мыть буфера и наконец загрузить пластину в лоток охлаждения образца.
Примечание: Снять крышку от капиллярной коробки, но не открывайте крышку от пробирного пластины. Крышки от пластины могут быть удалены автоматически инструмент при необходимости. Это помогает предотвратить реагент испарения. - Был запущен через несколько минут после запуска, строка состояния документа будет отображаться на экране компьютера. Индикаторы выполнения и сообщения о состоянии можно увидеть соответствующий инструмент текущего этапа.
Примечание: Первоначально, инструмент будет проверить все ли правильно, прежде чем приступить к Пипетка католит и анолит в лоток разделения, выбирать первый блок 12 капилляров, снять крышку плиты и размещение образцов из образца плита в капиллярах, а затем наконец в разделение камеру для электрофореза. - Нажмите кнопку на экране запуска резюме чтобы увидеть две области: состояние и разделения. Пользователи могут просматривать ход выполнения, а фильмы разделения (12 капилляров каждого цикла) могут быть сохранены после завершения шага электрофорез каждого цикла. Наблюдать за Разъединение электрофореза в капилляр, играть разделения фильм для этого капилляров, нажав желаемого цикла, а затем кнопку воспроизведения на панели управления.
- Выполняемый файл может храниться автоматически по завершении выполнения.
6. анализ данных (Рисунок S1)
- Откройте файл запуска и выберите вкладку анализ экрана. В Рисунке S1Aотображаются (пики) в графе образца данные из выбранного капиллярные (т.е., 4-й капиллярной из цикла 1).
- Нажмите кнопку изменить, а затем анализ (Рисунок S1B). На этом этапе пользователи могут изменить диапазон Пи, применять соответствующие Пи стандарт для данного эксперимента, добавить пик fit и добавить имя пик.
Примечание: При использовании рН 5-8 ampholyte премикс (как в данном случае), рекомендуемая Стандартная лестница использовать является одним с дневно обозначенные пептиды с НЦБ 4.9, 6.0, 6.4, 7.0 и 7.3, и при использовании рН 3-10 премикс, рекомендованные лестница является одним с НЦБ 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 и 7.3. 2 - Результаты отображаются на вкладке вершины; значения, отображаемые для образцов являются позиции, Пи, пик высотой и области, % площади, пик ширина и сигнал-шум (S/N) (Рисунок S1C). Выбрать, какие данные использовать и экспортировать данные для дальнейшего анализа.
Примечание: Данные могут быть экспортированы только после маркировки пик (Рисунок S1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн новой пробирного: Пробирного пластины схема приведена на рисунке 1A. Максимально 96 скважин может использоваться от 384-ну пластины в блоках 12 скважин для каждого условия (антител). Каждый блок 12 скважин можно запустить либо из A1-A12 и A13-A24. Цветом строк позволяют отличить образцы или реагенты друг от друга. В шаблоне пробирного (рис. 1B), соответствующую информацию для этого могут храниться конкретного анализа, который может использоваться на более поздних стадиях анализа результатов. Рисунок 1 c показывает резюме протокола.
Обнаружение белка фосфорилированных и unphosphorylated внеклеточные регулируемых киназы (pERK1/2 и ERK1/2) в HUVEC lysate стимулируется с VEGF: В общем после translationally модифицированных белков, таких как фосфолипопротеиновый, трудно обнаружить из-за их низкой количество и преходящий характер и отсутствие специфических антител. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) стимуляции после голодания сыворотки активирует рецептор тирозинкиназы (VEGFR2), приводит к активации MAPK путь и приводит к Эрк фосфорилирования. Для экспериментов с использованием HUVECs лизатов от клеток стимулируется с или без VEGF 7 мин может использоваться, как показано на рисунке 2. Рисунок 2A показывает electropherogram pERK1/2 от ± VEGF-стимулирует лизатов. Очевидно с VEGF существует очень высокий индукции фосфорилированных белков (пики, красным). Врезные показывает эндогенного загрузки управления HSP 70 (рисунок 2A вставкой), указанием аналогичные загрузки образцов для необработанных и обработанных образцов. В обычных immunoblot (рис. 2 cЛевая панель) лишь две группы были обнаружены (phosphoERK1; pERK1 и pERK2). Однако pERK1/2 белки были урегулированы в 4 вершины для ppERK2, pERK2, ppERK1 и pERK1 главный анализа (рис. 2A). Аналогично Рисунок 2B показывает electropherogram ERK1/2 от ± VEGF-стимулирует лизатов. Врезные показывает тот же элемент управления загрузки, используется параллельно. Обычных immunoblot показывает только две полосы, соответствующие ERK1 и ERK2 (рис. 2 cправая панель) тогда как главный, pERK1/ERK2 была решена в 6 пиков (Рисунок 2B) соответствует всем 4 различных фосфорилированных пики и 2 unphosphorylated вершин, ERK1 и ERK2. Это показывает, что одним из преимуществ с главный, а именно что изоформ белка может быть решена и оценены как качественно, так и количественно. Кроме того можно получить количественную информацию фосфорилированных изоформ от антитела направлены на основной белок, вместо того чтобы Посттрансляционная модификация.
Рисунок 1 : Проектирование пробирного пластины макета в программном обеспечении. (A) 384-ну пластины расположение определения позиции все реагенты. Цветную 12 хорошо строк указанием местоположения для образцов, антител и хемилюминесцентный реагенты. (B) assay шаблон показаны соответствующей информацией с отдельными хорошо. (C) протокол показаны всю соответствующую информацию для цикла 1 и 2. В цикл 1 (12 капилляров, как показано в цветной коробке), инструмент берет образец от A1 (скважины от A1-A12) следуют основного антитела от B1 (скважины от В1-В12), вторичные антитела от D1 (скважины от D1-D12) и наконец luminol:peroxide XDR от J1 (скважины от J1-J12). В 2-йцикл, все так же, как первого цикла, за исключением из C1 занимает основное антитело (скважины от C1-C12). Эта цифра была изменена с разрешения Аспинолл о '-ди et al. 2015 года2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Обнаружение белков фосфорилированных и общая Mitogen-Activated протеинкиназы (Эрк 1/2) главный пробирного и традиционных immunoblot пробирного. (A) Представитель electropherogram для pERK1/2 и белков в HUVECs лечение ±VEGFA следуют главный пробирного, проверяемые для антител pERK1/2. Синяя линия (кератоз) и красная линия (вынужденное). Вершины показывают по-разному фосфорилированных изоформ Перк/2, разделенных на основе их изоэлектрической точки. Врезные показывает внутреннего управления, HSP70 параллельно с же lysate. ()B) представитель electropherogram показаны ± ERK1/2 VEGFA-стимулирует lysate. Врезные показывает внутреннего управления HSP70, который был параллельно. Для electropherogram, были использованы lysate концентрации 50 мкг/мл, что эквивалентно 20 нг суммарных белков в капилляр. (C) обычных immunoblotting для pERK1/2 и ERK1/2 белков на ±VEGFA (50 нг/мл) стимулировала lysate клетки HUVEC. 10 мкг всего lysate за Лейн был использован для immunoblotting. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные Фигуры S1: этапы результата анализа
(A) Просмотр результатов от капиллярной интерес. (B) Изменить/добавить различные параметры для анализа файла. (C) Это можно добавить имена пик вершины перед экспортом данных для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чувствительность и разрешение белки имеют решающее значение для протеомических исследований биологических образцов. Существует большое значение в состоянии обнаружить белки, которые присутствуют в минуту количествах в клетках. Главный может предложить улучшена чувствительность и разрешение для обнаружения белков и их изоформы4.
Эта технология успешно используется в многих протеомических исследований отчеты5,6,7. Тем не менее некоторые ограничения, связанные с, например тот факт, что не все первичных антител может дать сигнал, даже если они хорошо работают в обычных иммуноблотов. Существует, пока список не проверенных антител, показано функционировать в главный, так как этот метод является довольно новой. Наконец инструмент не может обрабатывать меньше 12 образцов или более чем 96 образцов одновременно.
Главный представляет собой альтернативный метод для обычных immunoblotting, но она может не дают идентичные результаты. Главный было показано, быть намного превосходит обычные immunoblotting с точки зрения чувствительности и резолюции. Кроме того главный высокопроизводительных, надежных, автоматическая, роботизированные, и чувствительный, уступая сигналы от менее 25 клеток в зависимости от белка проанализированы1. Это количественные и высокую воспроизводимость, как обработка сводится к минимуму. Обнаружение различных изоформ белка аналогичных размеров может быть легко решена. Таким образом же антитела могут дать количественную информацию о формах фосфорилированных и unphosphorylated белка от нанограмм количества образца4. Хотя обычные immunoblot и главный полагаются на антитела на основе хемилюминесцентный обнаружения, есть некоторые важные различия, такие, как в обычных immunoblotting, белки разделяются на основе их молекулярный вес, тогда как в главный, разделение на основе белка бесплатно. Наконец протеины денатурированы в immunoblot, тогда как они сохранились в их родном государстве в главный. Этот последний пункт является причиной, почему же антитела могут или не могут работать в обоих методов.
Многие различные исследования продемонстрировали применение главный изучить фосфорилирование белков от человека пациентов образцов3, человека толстой кишки рак образцов4,8, мыши опухоль ткани9или различных клеточных линий 10. принятие этого метода может способствовать быстрый прогресс в протеомических исследований во многих областях таких лекарственных препаратов, диагностических целей, Биомаркеры обнаружения и сигнализации исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет никакой информации.
Acknowledgments
Автор благодарит Claesson профессор Лена-валлийский, Университет Уппсалы, Швеция для ее поддержки для разработки этого проекта. Кроме того Автор благодарит Росс Смит и Клаессон Лена-валлийский, Уппсальского университета за их критического чтения и предложения для улучшения рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
