Svært Sensitive og kvantitative påvisning av proteiner og deres isoformene av kapillær Isoelectric fokuserer metoden
Summary
Kapillært isoelectric fokus er et antistoff-basert, ultrasensitive, høy gjennomstrømming teknikk, muliggjør detaljert karakterisering av proteiner og deres isoformene fra svært små biologiske prøver. Følgende beskriver en protokoll for oppdagelse og kvantifisering av spesifikke proteiner og deres isoformene i en automatisert og robotisert måte.
Abstract
Immunoblotting har blitt en rutinemessig teknikk i mange laboratorier for protein karakterisering fra biologiske prøver. Følgende protokollen gir en alternativ strategi, kapillære isoelectric fokuserer (cIEF), med mange fordeler sammenlignet med konvensjonelle immunoblotting. Dette er et antistoff-basert, automatisert, rask og kvantitativ metode der en komplett vestlige blotting prosedyre finner sted i en supertynn kapillær. Denne teknikken ikke krever en gel å overføre til en membran, stripping av blots, eller x-ray filmer, som vanligvis kreves for vanlig immunoblotting. Her proteiner skilles i henhold til sine kostnader (isoelectric punkt, pI), bruker mindre enn en mikroliter (400 nL) totalt protein lysate. Etter geleelektroforese, proteiner er blokkert på capillary vegger av ultrafiolett lys behandling, etterfulgt av primære og sekundære (pepperrotperoksidase (HRP) konjugert) antistoff inkubasjon som bindende oppdages gjennom forbedret chemiluminescence (ECL), generere et lys signal som kan fanges opp og registrert av en kostnad – sammen enhet (CCD) kameraet. Det digitale bildet kan bli analysert og kvantifisert (peak området) ved hjelp av programvare. Denne høy gjennomstrømning prosedyren kan håndtere 96 prøver om gangen. er svært følsom, med proteinet oppdagelsen i hører området; og produserer svært reproduserbar skyldes automatisering. Alle disse aspektene er svært verdifull når antall prøver (f.eks, vevsprøver og biopsier) er en begrensende faktor. Teknikken har større programmer, inkludert screening av narkotika eller antistoffer, biomarkør oppdagelse og diagnostiske formål.
Introduction
Kapillær isoelectric fokus (cIEF) er en automatisert, kapillær-baserte immunanalyse som løser proteiner basert på deres kostnad1,2,3. Det er svært reproduserbare og i stand til å løse proteiner og deres post-translationally endret isoformene raskt og kvantitativt. Den presenterer et alternativ til konvensjonelle metoder som vestlige blotting. Mens vestlige blotting er veldig bra for å bekrefte tilstedeværelse av rikelig proteiner i lett tilgjengelig prøver; variasjon, tidsforbruk og nøyaktig kvantifisering alle tilstede utfordringer, særlig når undersøke biologiske vevsprøver. Faktisk variasjon er en iboende problem i vestlige blotting, som det er mange trinnene involvert, som laster inn og kjører SDS side gelé, overføring av proteiner på membran, inkubasjon med ulike reagenser (f.eks., primære og sekundære antistoffer, ECL), og utvikling på X-ray film4. Tiden, er den vestlige blotting teknikken bedre med implementeringen av digitale opptak av chemiluminescent signaler (digital westernfilmer). Nylig, et automatisert vestlige blotting system har blitt utviklet, nemlig av kapillær vestlige, som er et mer håndfri og gel-fri. Hele analysen er automatisert etter lasting av en prøve plate (eksempler med alle nødvendige reagenser) i systemet3,4. Instrumentet vil utføre alle skritt som protein separasjon, immobilisering av proteiner på kapillære veggen, antistoff incubations, vasker mellom forskjellige trinnene, og utvikling og kvantifisering av chemiluminescent signaler. Dermed gir cIEF prosedyren presenteres her høyere oppløsning og følsomhet.
Denne metoden er sensitiv, som signaler kan genereres og kvantifisert fra picograms proteiner1. Høy følsomhet med utmerket reproduserbarhet gjør denne teknologien svært nyttig for analyse av klinisk prøver. Det kan oppdage samt skille innlegget translasjonsforskning endring (f.eks annet fosforylert protein isoformene) av proteiner. Denne teknologien har blitt brukt til å analysere ulike signalnettverk trasé4,5 i kliniske studier å utvikle nye therapeutics i kreft3, og den har stort potensial for protein biomarkør og narkotika funnet .
Protocol
Representative Results
Discussion
Følsomhet og oppløsning av proteiner er avgjørende for proteomic forskning på biologiske prøver. Det er stor verdi i å kunne oppdage proteiner som finnes i mengder i celler. cIEF kan tilby bedre følsomhet og oppløsning for påvisning av proteiner og deres isoformene4.
Denne teknologien har blitt brukt i mange proteomic forskning rapporter5,6,7. Likevel er flere begrensn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren Takk Prof Lena Claesson-walisisk, Uppsala universitet, Sverige om hennes støtte for å utvikle dette prosjektet. I tillegg forfatteren Takk Ross Smith og Lena Claesson-walisisk, Uppsala universitet for kritisk lesing og forslag til å forbedre manuskriptet.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
