Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정
Summary
우리는 성공적으로 두 기판 전용 γ-secretase 분석 생성 된 있다. 여기에 제시 된 두 세포 기반 분석은 계량 반딧불 luciferase 기자 들의 출력을 통해 γ-secretase 효소 활동 설계 되었습니다.
Abstract
우리는 양적 측정 별개 기판의 γ-secretase 분열 하 셀 기반 리포터 유전자 분석 실험의 한 쌍을 개발 했습니다. 이 원고는 애플 리 케이 션-C99 또는 Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 노치의 γ-secretase 중재 분열을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 절차를 설명 합니다. 이 분석 실험 안정적으로 공동 Gal4 구동 luciferase 취재 원 유전자와 응용 프로그램 (애플 리 케이 션-C99;의 C-터미널 Gal4/VP16 태그 조각 HEK293 세포 transfecting에 의해 설립 되었다 Cg로 셀), 또는 Gal4/VP16 태그 노치-ΔE (NΔE; NG 셀)입니다. 동시에 이러한 기자 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 증명 하고있다 ErbB2 억제제, CL-387,785, 우선적으로 CG 셀에 애플 리 케이 션-C99 하지만 NG 셀에 NΔE 하지의 γ-secretase 분열을 억제 하실 수 있습니다. CL-387,785로 치료 하면 CG과 세포에 의해 전시 하는 차동 응답 γ-secretase 변조기에 대 한 선호 특성 나타내고 이러한 응답 γ-secretase DAPT에 의해 유도 된 팬 억제에 강한 대조에 있다. 우리의 연구는 다른 기판으로 γ-secretase 활동 세포 맥락에서 분화 될 수 있다 직접적인 증거를 제공 합니다. 이러한 새로운 분석 따라서 향상 된 광고 치료를 위한 약물 발견에 유용한 도구를 수 있습니다.
Introduction
아 밀 로이드 β (Aβ)의 oligomeric 모양은 neurodegeneration Alzheimer의 질병 (광고)1에서 고통 받는 환자의 두뇌에서의 주요 원인이 될 것으로 추정 된다. Aβ 펩 티 드 그리고 γ-secretase2β-secretase에 의해 처음으로 녹말 체 선구자 단백질 (APP)의 stepwise 분열에 의해 생산 됩니다. 지난 10 년간에서 광고의 치료로 치료 접근 Aβ 생산3의 예방에 집중 했다. 연구의 대부분은 애플 리 케이 션의 γ-secretase 분열을 배제 하 고 그로 인하여 Aβ의 생산 또는 β-및/또는 γ-secretase 활동4의 금지를 감소 수 있는 α-secretase 활동의 확대에 집중 했다. 불행히도, 피할 수 없는 부작용에 β 또는 γ secretases 결과의 비 선택적인 억제는 β와 γ-secretase5,6의 다른 생리 적인 기판의 기능 방해 예정 이다. Γ-secretase 억제제에 관한 최근 연구 화학 및 유전 변조기 노치7의 필수적인 γ-secretase 중재 처리에 사소한 영향을 발휘 하는 동안 Aβ 생산을 통제할 수 있는 수의 발견 보고 그러나 ,,89,10,11,12,, 성공적인 치료 아직 개발 하지 않은. 따라서, 더 체계적인 스크린은 보증 소설 유전과 화학 한정자 선택적으로 γ-secretase 중재 애플 리 케이 션 처리를 조절 수 있습니다 발견.
Γ-Secretase 이상의 90 다른 막 정박 단백질을 쪼개로 알려져 있다. 이러한 기판 중 그 활동은 세포 운명 결정과 분화 개발13과정에 대 한 중요 한 단계가입니다. 선택적으로 변조 γ-secretase 촉매 응용 프로그램 부재에 처리에 영향을 미치는 노치의 처리 부작용에 대 한 최소화 노치 관련 γ-secretase 억제제의 필수적인 되며이 선택도 기본 요소가 될 것으로 생각 됩니다. 광고의 만성 치료에 대 한 잠재적인 γ-secretase 변조기의 생물학적 효능을 지정 합니다. 다양 한 arylsulfonamide 유도체, GSI-953 (begacestat) 등 BMS-708163 (avagacestat), γ-secretase14,15의 강력 하 고 선택적인 억제를 전시 발견 되었습니다 되었습니다. 이전 연구는 APP와 노치의 γ-secretase 분열의 차동 저해 조합 vivo에서 유효성 검사 zebrafish16를 사용 하 여 양이 많은 ELISA 기반 분석 결과 사용 하 여 관찰 될 수 있다 설명 했다. 또한, 세포 기반 분석 결과 패러다임 γ-secretase 애플 리 케이 션 및 노치17,18대의 잠재적인 기판 선택도 해결 하기 위해 설립 되었습니다. 여기 설명한 비슷한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 최근에 발견 (D)의 소설 클래스-potently 노치를 살려주는 선택도19APP의 γ-secretase 분열을 조절 하는 leucinamides. 함께,이 연구의 제공의 증거-개념 γ-secretase의 기판 선택/가용성 화학 변조 및 실험 검증 대상이 될 수 있는 개념을 지 원하는 됩니다. 그러나, 이러한 분석 결과 플랫폼 종종 상대적으로 낮은 처리량 판독 및 약물 발견 프로그램에 대 한 산업 표준에 맞지 수 있습니다 노동 집약적인 접근에 의존 합니다.
우리는 최근 셀 기반 luciferase 취재 원 유전자 분석 실험 양적 γ-secretase 두 가지 기판, APP (응용 프로그램-C99)의 99 아미노 산 성 C 터미널 단편과는 세포 외의 촉매 활동을 확인할 수 있는 생성 된 도메인 삭제 노치 펩 티 드 (NΔE)입니다. 애플 리 케이 션-C99 및 NΔE γ-secretase 다양 한 분석 실험에서의 직접 기판으로 널리 사용 되었습니다 있다. 균일 하 고 일관 된 luciferase 리포터 유전자 분석 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-secretase 분열에 대 한 생성, 우리 생성 한 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (CG) constitutively Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 (표현 하 Gal4-Luc)와 Gal4/VP16 태그 애플 리 케이 션-C99 융합 단백질 (C99-GV). 또한, constitutively Gal4 루크와 Gal4/VP16 태그 NΔE (NΔE-GV)를 표현 하는 또 다른 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (NG)를 생성 했습니다. 이러한 새로운 기판 전용 γ-secretase 분석 실험을 사용 하 여, 우리 이제 계량 하 고 γ-secretase 별개 기판 (애플 리 케이 션-C99 CG 세포에서) 또는 NG 셀에 NΔE로의 촉매 활동을 구별 하는 방법을 제공 합니다. 또한, 기판 전용 γ-secretase 분석 실험이 콘텐츠 심사 플랫폼에 도움이 되도록 설계 되었습니다. 이 새로 생성 된 γ-secretase 분석 도출 다음-세대 치료에 대 한 바람직하지 않은 노치 저해 하지 않고 Aβ 생산을 억제 하 여 인지 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 있는 소설 γ-secretase 변조기의 발견에 대 한 길을 닦은 수 있습니다. 광고.
Protocol
Representative Results
Discussion
광고에 대 한 aducanumab immunotherapy의 단계 1b 재판에서 유망한 결과 단단히 광고22 의 병 인에 Aβ의 중요 한 역할을 설립 하 고 안티-Aβ 접근은 여전히 안티 광고 약물의 개발에 대 한 실행 가능한 전략을 제안. 여기, 우리는 애플 리 케이 션-C99 및 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 NΔE의 γ-secretase 촉매 베이스 측정을 위한 세포 기반 분석 설명 합니다. 응용 프로그램-C99 및 NΔE?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 지원에 대 한 연구소의 휴대 및 Organismic 생물학, 학계 Sinica의 핵심 시설을 감사합니다. 이 연구는 과학과 기술, 대만 (Y. f 가장 103-2320-B-001-016-MY3에 의해 지원 되었다 L.), 의약품 개발-기술 플랫폼 축 지원의 변환 혁신 프로그램 (Y. 플로리다에 NP7) 체계, 그리고 학계 Sinica (하 영-플로리다).
Materials
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
- Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
- Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer’s disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Citron, M. Alzheimer’s disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
- Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer’s disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
- Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
- Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
- Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
- Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
- Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer’s disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
- Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
- He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer’s disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
- Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
- Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
- Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
- Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15 (2008).
- McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
- Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer’s disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).
- Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
- Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
- Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
- Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer’s disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
- Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
- Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
- Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
- Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer’s Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).
