Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter
Summary
Estamos com sucesso geraram dois ensaios de substrato específico γ-secretase. Ambos os ensaios cell-based aqui apresentados destinam-se para quantificar o γ-secretase actividades enzimáticas através da saída de repórteres de luciferase de vaga-lume.
Abstract
Nós desenvolvemos um par de ensaios de gene repórter baseada em célula para medir quantitativamente a clivagem de γ-secretase de substratos distintos. Este manuscrito descreve procedimentos que podem ser usados para monitorar a clivagem γ-secretase-mediada de APP-C99 ou entalhe, utilizando um sistema de repórter Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase. Estes ensaios foram estabelecidos por estàvel co transfecting células HEK293 com o gene do repórter do luciferase orientado a Gal4 e o fragmento de Gal4/VP16-marcados C-terminal da APP (APP-C99; Células CG), ou a Gal4/VP16-tag entalhe-ΔE (NΔE; Células de NG). Usando estes ensaios de repórter em paralelo, temos demonstrado que um inibidor ErbB2, CL-387.785, preferencialmente pode suprimir a clivagem de γ-secretase de APP-C99 em células CG, mas não NΔE em células de NG. As diferenciais respostas exibidas pelas células CG e NG, quando tratados com CL-387.785, representam uma característica preferencial para moduladores de γ-secretase, e essas respostas estão em contraste com a pan-inibição de γ-secretase induzido por DAPT. Nossos estudos fornecem a evidência direta que γ-secretase atividades em direção a diferentes substratos podem ser diferenciadas em um contexto celular. Estes novos ensaios, podem ser ferramentas úteis na descoberta da droga melhorada das terapias AD.
Introduction
Oligoméricas formas de amiloide-β (Aβ) são acreditadas para ser a causa primária de neurodegeneração nos cérebros de pacientes que sofrem de doença de Alzheimer (AD)1. Peptídeos aβ são produzidos pela gradual clivagem da proteína precursora amiloide (APP), primeiro por β-secretase e depois por γ-secretase2. Na década passada, abordagens terapêuticas para o tratamento da AD têm-se centrado na prevenção da produção de Aβ3. A maioria dos estudos focaram-se também o aumento da atividade de α-secretase, que pode impede a clivagem de γ-secretase de APP e, assim, diminuir a produção de Aβ, ou a inibição da β-e/ou γ-secretase atividades4. Infelizmente, não-seletivo da inibição da β ou γ-secretases resultados em inevitáveis efeitos colaterais que são devido à interferência com o funcionamento de outros substratos fisiológicos de β e γ-secretase5,6. No que se refere a inibidores de γ-secretase, estudos recentes relataram a descoberta de um número de moduladores químicos e genéticos que podem regular a produção de Aβ enquanto exercer efeitos insignificantes sobre o tratamento de γ-secretase-mediada essencial de entalhe7 ,8,9,10,11,12, no entanto, terapêutica bem sucedida ainda não foram desenvolvidas. Assim, ainda mais sistemáticas telas são garantidas para descobrir novos modificadores de genéticas e químicas que podem seletivamente modular γ-secretase-mediada processamento de APP.
Γ-Secretase é conhecido para cravar mais de 90 diferentes proteínas de membrana-ancorado. Entre estes substratos é entalhe, cuja actividade é fundamental para a determinação do destino de célula e diferenciação durante desenvolvimento13. Seletivamente a modular γ-secretase-catalisada APP processamento na ausência de afectar o entalhe processamento será essencial para minimizar efeitos colaterais relacionados com entalhe de γ-secretase-inibidores, e esta seletividade é pensada para ser um fator principal que será dite a eficácia biológica de moduladores de γ-secretase potenciais para o tratamento crônico da AD. Tem havido um número de derivados de arylsulfonamide, tais como o GSI-953 (begacestat) e BMS-708163 (avagacestat), que foram encontrados para exibem inibição potente e seletiva de γ-secretase14,15. Um estudo anterior demonstrou que a inibição diferencial de γ-secretase clivagem da APP e entalhe pode ser observada usando um ensaio quantitativo ELISA-baseado em combinação com validação no vivo usando zebrafish16. Além disso, foram estabelecidas paradigmas baseada em célula de ensaio para abordar a potencial seletividade de substrato de γ-secretase em direção a APP e o entalhe de17,18. Usando protocolos semelhantes as descritas neste documento, nós descobrimos recentemente uma nova classe de (D)-leucinamides que potente modular γ-secretase clivagem da APP com entalhe poupadores seletividade19. Juntos, esta coleção de estudos fornece um prova de conceito a noção de que a seletividade/disponibilidade de substrato de γ-secretase podem estar sujeitas a modulação química e verificação experimental de apoio. No entanto, essas plataformas de ensaio muitas vezes dependem de relativamente baixa produtividade leituras e abordagens de trabalho intensivos que não podem cumprir padrões industriais para programas de descoberta de drogas.
Nós recentemente geraram ensaios de gene do repórter do luciferase baseada em célula que quantitativamente podem determinar a atividade catalítica de γ-secretase em direção a dois substratos distintos, 99-amino ácido fragmento C-terminal da APP (APP-C99) e o extracelular domínio-excluído peptídeo Notch (NΔE). Tanto APP-C99 e NΔE foram amplamente utilizados como substratos diretos de γ-secretase em vários ensaios. Para gerar ensaios de gene repórter do luciferase homogênea e consistente para a clivagem de γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, geramos uma linha de HEK-derivado de célula estável (CG) que constitutivamente expressa um Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase repórter ( Gal4-Luc) e a proteína de fusão Gal4/VP16-com a tag APP-C99 (C99-GV). Além disso, geramos uma outra linha de HEK-derivado de célula estável (NG) que constitutivamente expressa Gal4-Luc e NΔE Gal4/VP16-marcados (NΔE-GV). Usando estes ensaios romance substrato específico γ-secretase, agora oferecemos um método para quantificar e distinguir a atividade catalítica de γ-secretase em direção a diferentes substratos (APP-C99 em células CG), ou NΔE em células de NG. Além disso, os substrato específico γ-secretase ensaios foram projetados para ser propício para plataformas de triagem de alto teor. Estes ensaios γ-secretase recém-gerado poderiam pavimentar o caminho para a descoberta de moduladores de γ-secretase romance que poderia melhorar a função cognitiva, suprimindo a produção de Aβ sem suscitar indesejável inibição de entalhe para o tratamento de última geração do anúncio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os resultados promissores de um fase 1b ensaio de aducanumab imunoterapia para AD estabeleceram firmemente o papel crítico de Aβ na patogênese da AD22 e sugerem que abordagens anti-Aβ ainda são uma estratégia viável para o desenvolvimento de drogas antianúncios. Aqui, descrevemos ensaios cell-based, para quantificar a proteólise γ-secretase-catalisada de APP-C99 e NΔE usando sistemas de repórter de luciferase de vaga-lume. APP-C99 e NΔE são os dois substratos de γ-secretase mais bem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças a facilidade do núcleo do Instituto de celular e biologia organísmica, Academia Sinica, apoio técnico. Este estudo foi suportado pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan (mais-103-2320-B-001-016-MY3 para Y.-F. L.), o programa de inovação translacional de Biofarmacêutica desenvolvimento – tecnologia de apoio a plataforma eixo regime (NP7 para Y.-F.L.) e Academia Sinica (para Y.-F.L.).
Materials
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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