Evaluación de terapias con células madre en un modelo de lesión del tendón patelar Bilateral en ratas

Summary

Este papel describe la preparación y la evaluación del cordón umbilical células madre mesenquimales derivadas de matriz esferoides con un modelo de defecto del tendón patelar bilateral en una rata. Este modelo se asocia con una morbilidad aceptable y encontraron para detectar diferencias entre los tendones no tratados y tratados y entre los dos tratamientos probado.

Abstract

Medicina regenerativa ofrece nuevas alternativas a las condiciones que desafían a los tratamientos tradicionales. La prevalencia y morbilidad de tendinopathy en especies, combinada con las limitadas propiedades curativas de este tejido, han promovido la búsqueda de terapias celulares y propulsó el desarrollo de modelos experimentales para el estudio de su eficacia. Cordón umbilical derivados de matriz células madre mesenquimales (MSC-UCM) son candidatos atractivos porque son abundantes, fáciles de recoger, eludir las preocupaciones éticas y el riesgo de formación de teratoma, sin embargo, se asemejan a las células madre embrionarias primitivas más estrechamente que interés de MSCs. significativas derivadas de tejido adulto se ha centrado en quitosano como una estrategia para mejorar las propiedades de MSCs mediante formación esferoide. Estas técnicas de información de papel para aislar UCM-MSCs, preparar esferoides en la película de quitosano y analizar el efecto de formación esferoide en expresión superficial del marcador. En consecuencia, creación de un modelo de lesión del tendón patelar bilateral en ratas se describe para la implantación de en vivo de esferoides UCM-MSC formado en la película de quitosano. Ninguna complicación se observó en el estudio con respecto a la morbilidad, estrés aumento de efectos, o infección del tejido. La puntuación total funcional de las ratas operadas a los 7 días fue más baja que la de las ratas normales, pero volvió a la normalidad dentro de 28 días después de la cirugía. Resultados histológicos de curación de tejido confirman la presencia de un coágulo en defectos tratados evaluados a los 7 días, ausencia de reacción del cuerpo extranjero y progresiva curación a los 28 días. Este modelo de defecto del tendón rotuliana bilateral controla variación interindividual mediante la creación de un control interno en cada rata fue asociado con morbilidad aceptable y permitieron la detección de diferencias entre los tendones no tratados y tratamientos.

Introduction

Lesión del tendón es una de las causas más comunes de atrofia muscular y dolor significativa de especies¹. En medicina veterinaria, lesiones de tendones y ligamentos son de especial interés en los caballos, ya que 82% de las lesiones en caballos de carrera implican el sistema músculo-esquelético, 46% de los que afectan a los tendones y los ligamentos^2,3. Formación de tejido cicatricial afecta las propiedades biomecánicas de los tendones curadas y explica el pronóstico guardado para volver a uso deportivo después de lesiones del tendón flexor; nueva lesión ocurre dentro de 2 años en hasta un 67% de los caballos tratados conservador⁴. Medicina regenerativa ofrece nuevas alternativas a una condición que desafía a los tratamientos tradicionales. Terapia de células madre autólogo ha producido algunos resultados alentadores^5,6 pero está limitada por la morbilidad asociada con la colección de tejidos, administración retardada debido a procesamiento/reprogramación de las células y la influencia de la Estado de salud del paciente (como la edad) en las propiedades del tallo las células^7,8. Estas limitaciones proporcionan un fundamento para la investigación de células madre alogénicas como alternativa inmediata. Células fetales derivados del adnexa son candidatos atractivos ya que eluden las preocupaciones éticas y el riesgo de formación de teratoma con células madre embrionarias. Entre los anejos fetales, matriz del cordón umbilical (UCM), también llamado gelatina de Wharton, es abundante y fácil de recoger.

Independientemente de la fuente de la célula, mejorando la troncalidad es esencial para establecer un banco de células para la medicina regenerativa alógeno. Desde un punto de vista funcional, la troncalidad puede definirse como la posibilidad de auto renovación y multilineal diferenciación⁹. Evidencia de la troncalidad basa en la proliferación y diferenciación ensayos, junto con la expresión de marcadores gen Oct4, Sox2 y Nanog⁹. Una estrategia para mejorar la troncalidad se basa en la utilización de Biomateriales para servir como vacíos rellenos y portadores, mejorar la proliferación y la diferenciación de MSCs de la UCM. Este enfoque elimina preocupaciones con respecto a la manipulación de factores transcripcionales para reprogramar las células maduras en células pluripotentes inducidas. Entre los biomateriales consideradas como posibles portadores de células madre, chitosan es atractiva por su biocompatibilidad y biodegradabilidad¹⁰. Este aminopolysaccharide natural está formado por desacetilación alcalina de la quitina, el polisacárido natural más abundante en segundo lugar, que principalmente se obtiene como un subproducto de mariscos¹⁰. Previamente hemos investigado las interacciones entre MSCs y andamios de quitosano y observó la formación de esferoides^{11,12,13,14,15, 16}. también informó sobre la superioridad de la condrogénesis en quitosano matrices^{12,13,14,15,16,17, 18}. Más recientemente, dos estudios independientes describen formación de esferoides por tejido adiposo y tejido de placenta derivados MSCs cultivadas en una película de quitosano^19,20. Esta formación de esferoides no sólo había mejorado troncalidad, pero también mejora la retención de las células madre después de en vivo implantación²⁰.

La prevalencia y morbilidad de la Tendinopatía entre especies han impulsado el desarrollo de modelos experimentales para estudiar la fisiopatología de las tendinopatías y probar nuevas terapias como las inyecciones de células madre. En los caballos, tendonitis colagenasa-inducido es un modelo común para demostrar la eficacia utilizando MSCs en reparación de tendón²¹. La relevancia de este enfoque es limitada, como las inyecciones provocan cambios inflamatorios agudos, mientras que clínica tendinopatías generalmente son el resultado de crónica agotamiento extremo^22,23. Además, la inducción química de la enfermedad del tendón induce una respuesta curativa y no reproduce el proceso de curación deteriorado en casos clínicos^22,23. Supresión de un segmento de tendón del flexor digital superficial ha sido descrita como un modelo quirúrgico de la tendinitis en caballos²⁴. Más recientemente, se utilizó un acercamiento como mínimo invasor para restringir el daño traumático a la base central del tendón del flexor digital superficial²⁵. Los modelos quirúrgicos no simulan el mecanismo de fatiga que puede conducir a la enfermedad natural del tendón y tienden a la falta de reproducibilidad en el grado de daño creado²⁵. Sin importar el modelo, la morbilidad y costes asociados con modelos equinos del tendón enfermedades son limitaciones adicionales, que justifican un interés en modelos de roedores como un primer paso para la evaluación en vivo de nuevas terapias.

Una de las principales ventajas de los modelos experimentales en roedores consiste en el costo y la capacidad de controlar la variabilidad interindividual. Roedores pueden ser normalizados con respecto a varios factores fisiológicos debido a sus rápidas tasas de crecimiento y relativamente corta longevidad, limitando las fuentes de variación y por lo tanto reduciendo el número de animales necesarios para detectar diferencias. Estrategias para inducir enfermedades del tendón en roedores se han basado en inducción de la química, sino también en creación quirúrgica de defectos parciales del tendón²¹. Modelos quirúrgicos pueden simular tendinopatías natural mejor que los modelos químicos, pero pueden conducir a mayor morbilidad y fallas catastróficas del tendón dañado. En ese sentido, las ratas parecen mejores candidatos que los ratones para estos modelos, ya que su tamaño permite creación de defectos más grandes, facilitando la evaluación de la curación del tejido. Se han utilizado ratas Sprague-Dawley en estudios experimentales de tendinopatías en cuatro grupos principales del tendón: rotura del manguito rotador, flexor, Aquiles y tendones patelar²⁶. Entre ellos, modelos que involucran el tendón rotuliano están especialmente atractivos debido al tamaño de este tendón y la facilidad de acceso a²⁷. El tendón rotuliano fija el músculo cuádriceps a la tuberosidad tibial. Dentro de este mecanismo extensor, la rótula es un hueso sesamoideo que se dirige la acción de los cuádriceps y delinea la parte proximal del tendón rotuliano. La presencia de anclajes óseos en las extensiones proximales y distales del tendón rotuliano facilita pruebas biomecánicas. Modelos que involucran el tendón rotuliano típicamente dependen de defectos quirúrgicos unilaterales, con un tendón intacto contralateral que sirve como un control^28,29. El modelo más común de defecto de tendón rotuliano consiste en suprimir la parte central (a 1 mm de ancho) del tendón rotuliano de la cúspide distal de la rótula a la inserción de la tuberosidad tibial, mientras que el tendón rotuliano contralateral quedo intacto. Medidas de resultados incluyen histología, no biomecánicos destructivos o ensayos biomecánicos al fracaso, proyección de imagen de ultrasonido, ex vivo imágenes de fluorescencia, bruto observación y pruebas funcionales^{28,30 ,31}. Modelos unilaterales no permiten comparación de un tratamiento propuesto con la gerencia conservadora de una lesión similar en el mismo animal. Del mismo modo, comparación entre varios tratamientos requiere animales separados. Un modelo bilateral eliminaría las variaciones interindividuales y reducir el número de animales requeridos para un estudio de³². Sin embargo, lesiones bilaterales pueden aumentar la morbilidad, y cojera bilateral podría impedir la evaluación del tratamiento. Algunos estudios reportan brevemente el uso de defectos bilaterales del tendón patelar en ratas pero se centran sobre los efectos de los tratamientos en lugar de administración perioperatoria y la morbilidad del modelo^33,34.

Objetivo a largo plazo de este estudio es desarrollar una estrategia para mejorar la supervivencia de la troncalidad celular e in vivo de la UCM-MSCs destinada a trasplante alógeno. Para lograr este objetivo, hemos informado recientemente mejorado troncalidad de MSCs UCM por formación de esferoides en la película de quitosano e incubación en ambiente hipóxico³⁵. Estas propiedades en vitro se asociaron con mejores propiedades biomecánicas del tendón rotuliano defectos tratados con acondicionado UCM-MSCs. basado en estos resultados, el modelo de rata del tendón patelar bilateral defecto parece conveniente probar candidato tratamientos para lesiones de tendón³⁶. El objetivo del estudio aquí reportado es proporcionar protocolos detallados para aislamiento y caracterización de la UCM-MSCs, preparación de un sistema biológico para las células de vástago, creación y tratamiento de defectos de tendón rotuliana bilateral y en el post-operatorio recuperación y evaluación de la curación dentro de los defectos del tejido.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Western University of Health Sciences. 1. aislamiento y expansión de MSCs de matriz equina del cordón Umbilical Obtener la placenta de una yegua adulta (embarazada) después de observado parir y aislarlo asépticamente el cordón umbilical de la placenta. Mantener el cordón umbilical en tampón fosfato salino (PBS) con 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ?…

Representative Results

En el estudio actual, los resultados se presentan como media ± SD (desviación estándar). Las células fueron aisladas de los cordones umbilicales de 6 yeguas, y porcentaje de líneas celulares aisladas de expresar cada marcador superficial de la célula bajo acondicionado estándar o quitosano se compararon con una prueba de Friedman, como un análisis no paramétrico de varianza con repetidos medidas. Para la creación de modelo de defecto del tendón, se utilizaron 8 ratas para la ev…

Discussion

Células equinas fueron seleccionadas para este proyecto porque finalmente vamos a prueba enfoques de candidato en el tratamiento de tendinopatías natural en caballos. De hecho, lesiones de los tendones en los caballos son atractivos como modelos naturales de tendinopathy en el hombre debido a la similitud biológica entre el equino flexor digital superficial y el tendón de Aquiles en los seres humanos⁴¹. Los célula marcadores de superficie CD44, CD90, CD105, CD34 y MHC II se seleccionaron para…

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable