חלקיקים מגנטיים-DNA מחייב ניתוח לפי פיזור אור דינאמי, Electrophoretic
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של חלקיקים מגנטיים והערכה של תכונותיהם מחייב הדנ א באמצעות פיזור אור דינאמי ו electrophoretic. שיטה זו מתמקדת ניטור שינויים גודל החלקיקים, polydispersity שלהם, פוטנציאל זטה משטח החלקיקים אשר משחק מייג’ור תפקיד הכריכה של חומרים כגון ה-DNA.
Abstract
בידוד של דנ א באמצעות חלקיקים מגנטיים הוא תחום בעל חשיבות גבוהה במחקר ביוטכנולוגיה וביולוגיה מולקולרית. פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של חלקיקים מגנטיים דנ א איגוד באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS), פיזור אור electrophoretic (ELS). ניתוח לפי DLS מספק מידע חשוב על המאפיינים physicochemical של חלקיקים כולל גודל החלקיקים, polydispersity פוטנציאל זטה. השנייה מתארת את המטען משטח של החלקיק אשר ממלא תפקיד חשוב ב איגוד אלקטרוסטטית של חומרים כגון ה-DNA. . הנה, ניתוח השוואתי מנצלת שלושה שינויים כימיים של חלקיקים, microparticles והשפעתם על איגוד ה-DNA ו • תנאי. שינויים כימיים על ידי הקנים polyethylenimine, triethoxysilane orthosilicate ו- (3-aminopropyl) tetraethyl נחקרות. מאז ה-DNA תערוכות מטען שלילי, הוא צפוי כי פוטנציאל זטה משטח חלקיקים יקטן בעת איגוד ה-DNA. הקמת אשכולות צריך להשפיע גם על גודל החלקיקים. על מנת לחקור את היעילות של החלקיקים בבידוד, • תנאי ה-DNA, החלקיקים מעורבבים עם ה-DNA ב pH נמוך (~ 6), חוזק יוניים גבוהה וסביבה התייבשות. חלקיקים נשטפים על מגנט, אז ה-DNA הוא eluted על-ידי מאגר טריס-HCl (ה-pH = 8). ה-DNA עותק מספר מוערך באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (PCR). פוטנציאל זטה, גודל החלקיקים, polydispersity ונתונים PCR כמותי מוערכים, בהשוואה. DLS הוא שיטת ניתוח זה מוסיף פרספקטיבה חדשה תהליך ההקרנה של חלקיקים עבור בידוד של דנ א של תובנה ותמיכה.
Introduction
בידוד ה-DNA הוא אחד הצעדים החיוניים ביותר בביולוגיה מולקולרית. בפיתוח שיטות החילוץ חומצת גרעין יש השפעה רבה על השדות המתעוררים גנומיקה, metagenomics, אפיגנטיקה ו transcriptomics. יש מגוון רחב של הביו-טכנולוגיה אפליקציות לבידוד DNA כולל רפואי (משפטית/אבחון וכלים prognostic סמנים ביולוגיים) ויישומים סביבתיים (metagenomic המגוון הביולוגי השכיחות של הפתוגן, מעקב). יש כבר הגדלת הביקוש כדי לטהר ולבודד את הדנ א מחומרים שונים, בצורות שונות כגון דם, שתן, אדמה, עץ, סוגים אחרים של דגימות. 1 , 2 , 3 , 4
ננו, מיקרו-חלקיקים בגודל מתאימים בידוד ה-DNA בשל השטח שלהם גבוהה, במיוחד כאשר הם יכולים להיות משותק על ידי שדה מגנטי. המאפיינים physicochemical של חלקיקים, כמו למשל גודל או תשלום, יכול להשפיע באופן משמעותי את היכולת שלהם לאגד היעד מולקולות. 5 כדי לשפר עוד יותר את הכריכה של מולקולות וכדי לייצב חלקיקים, שינויים כימיים שונים (משטח ציפוי) יכול להיות מנוצל. האסטרטגיות השונות רבים עבור איגוד מסווגים לפי אינטראקציות קוולנטיות, הלא-כך. 6 גודל החלקיקים משפיע ישירות על תכונותיהם מגנוט, ואילו החלקיקים קומפוזיציה התפורות על ידי שילוב של מתכת, סגסוגת וחומרים אחרים יכולים להשפיע על צפיפות, נקבוביות ואת השטח שלה. 7 אין שום דרך אמינה כדי למדוד את משטח הטעינה של חלקיקים קטנים. במקום זאת, ניתן למדוד פוטנציאל חשמלי על המטוס הגולשות (מרחק מן השטח ננו-חלקיק). 8 ערך זה נקרא זטה פוטנציאליים, זהו כלי חזק שבדרך כלל משמשת להערכת יציבות ננו – ו microparticle ויה DLS. 9 מאז שהערך שלו אינו מאוד, תלויים לא רק ה-pH יוניים חוזק ואנליזת הסביבה, אלא גם את מאפייני השטח של החלקיקים, היא יכולה גם להוכיח את השינויים במשטח זה נגרמת על ידי האינטראקציה בין חלקיקים, מולקולה של ריבית. 10
מצד שני, מבנה ה-DNA בתנאים יבשים (טופס א’-DNA) המוצגים הדחוס הייצורים החיים המאפשרים שלה משקעים (צבירת) בהשוואה ל בדרך כלל מתרחשת טופס B-DNA. אלקטרוסטטית (יוניים ו- H-בונד) הם הכוחות העיקריים שליטה הכריכה של ה-DNA לחומרים אחרים בשל שלהם פוספט sterically נגיש ובסיסים חנקן (במיוחד גואנין). 7 , 10
בעבודה זאת, מנותחים שלושה שינויים כימיים נציג של חלקיקים מגנטיים, microparticles (איור 1 א’). השיטה של סינתזה, שינוי כימי של חלקיקים, microparticles מתואר. פתרון מחייב, כי הסכמי לעקרונות תיאורטיים למשקעים דנ א (pH כוח יונית, התייבשות), משמשת להערכת איגוד ה-DNA ו • תנאי. ה-PCR כמותי משמש כדי להעריך את היעילות • תנאי ה-DNA חלקיקים נציג ו microparticles (איור 1B). גודל החלקיקים, polydispersity אינדקס, פוטנציאל זטה הם פרמטרים חשובים המשמשים כדי להמחיש את השינויים physicochemical המתרחשות על פני השטח של חלקיקים (איור 1C). חשוב להדגיש על אפיון כימי משטח חלקיקים מגנטיים. שלב זה היה מעבר להיקף של פרוטוקול זה, ניתן להחיל מספר טכניקות מודרניות כדי לחקור את היעילות של שינויים כימיים. 11 , 12 , 13 , 14 ספקטרוסקופיית מעבר פורייה (FTIR) ניתן להשתמש כדי להעריך את ספקטרום אינפרא-אדום של חלקיקים משטח להשוות אותה. הספקטרום של מכפילי כימי חינם. Photoelectron הספקטרומטריה (XPS) היא טכניקה נוספת שיכול לשמש כדי לזהות הרכב היסודות של השטח גשמי. ניתן להשתמש בשיטות אחרות אלקטרוכימי, מיקרוסקופיים, ספקטרוסקופיות לשפוך האור על האיכות של סינתזה של חלקיקים. עבודה זו מדגיש מבט חדשה לניתוח אינטראקציות DNA-מגנטית חלקיקים באמצעות DLS.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה, היו העקרונות התיאורטיים להסביר מחייב DNA חלקיקים מגנטיים באמצעות פוטנציאל זטה תחת שאלה. הפרוטוקול מתאר את סינתזה של שינוי של חלקיקים מגנטיים ו- microparticles. שיטת ההכנה של פתרון ה-DNA ואיגוד פקד, מתוארים גם. שתי אסטרטגיות מוצגות כאן להקרנה של ה-DNA-החלקיקים אינטראקציות: ה-PCR כמותי של DLS מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה הכלכלית על ידי קרן המדע הצ’כית (פרוייקט GA CR 17-12816S) 2020 CEITEC (LQ1601) הוא הודה באופן משמעותי.
Materials
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
