Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama
Summary
İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.
Abstract
Biyo-katman Interferometry (BLI) tahlil protein-protein ve protein-küçük molekül etkileşimleri ölçmek için değerli bir araçtır. Burada, ilk romanı bu etiket içermeyen teknik uygulanması insan EAG1 etkileşiminin çalışma için tarif (hEAG1) kanal proteinler küçük molekül PIP2. hEAG1 kanal potansiyel terapötik hedef olarak onun anormal overexpression kanserler ve birkaç işlev kazanç mutasyonlar nörolojik hastalıklar bazı türleri dahil nedeniyle kabul edilmiştir. HEAG1 kanal proteinler bir memeli istikrarlı ifade sisteminden saflaştırılmış ve PIP2 BLI tarafından etkileşim ölçülür. HEAG1 protein ve PIP2 arasında bağ Kinetik başarılı ölçümü BLI tahlil iyon kanal Farmakoloji roman küçük molekül ligand tarama için kullanılan bir potansiyel yüksek üretilen iş yaklaşımı göstermektedir.
Introduction
Hücre yüzey erişilebilir iyon kanal proteinler küçük moleküller ile hedefleme ligand tarama ve biyolojik ilaç keşif1,2,3için muazzam bir potansiyel sunmaktadır. Böylece, uygun bir araç iyon kanal ve küçük moleküller ve onların karşılık gelen işlev arasındaki etkileşimi eğitimi için gereklidir. Yama-kelepçe kayıt iyon kanal fonksiyonel tahlil bir eşsiz ve yeri doldurulamaz teknik olmak kanıtlanmıştır. Ancak, diğer teknolojiler gerektirir küçük moleküller doğrudan iyon kanalları hedef olup olmadığını belirleme. Geleneksel olarak, radyoaktif ligand bağlayıcı tahlil onun hedef iyon kanal protein arasındaki küçük molekül bağı Kinetik gözlemlemek için kullanıldı. Ancak, bu tekniğin kullanımı onun gereksinimi nedeniyle radyoaktif etiketleme ve algılama sınırlıdır. Ayrıca, çalışma odasında küçük ligand etiketlemek için önkoşul adım onun iyon kanalları bilinen belirli ligand olmadan birçok türleri kullanarak engeller. Bazı etiket içermeyen teknikleri NMR spektroskopisi, x-ışını kırınım, microscale thermophoresis (MST)4 ve yüzey plasmon rezonans (SPR) gibi protein-küçük molekül etkileşimleri ölçmek için kullanılmaktadır. Ama bu tür deneyleri genellikle zorluk nedeniyle tam uzunlukta protein, düşük çözünürlüklü dynamics, iş hızı düşük ve yüksek maliyet5almak için yeterli bilgileri sağlayamaz. Bu tekniklerin aksine, biyo-katman Interferometry (BLI) protein-küçük molekül etkileşimleri küçük miktarlarda protein örnek yüzeylerinde immobilizing tarafından tespit için bu sakıncaları üstesinden gelmek için yeni bir etiket içermeyen metodoloji olarak ortaya çıkıyor Biyoalgılayıcı ve optik değiştirme ölçme sinyalleri6,7. Umut verici bir Biyoalgılayıcı platform olarak alma tekniği zaten küçük moleküller arasındaki etkileşimin doğal su ile bir insan monoklonal antikoru CR80208 gibi çözünebilir proteinler gözlemlemek için gerçekleştirilir ve detaylı tahlil yordamı bildirilmiştir bir Önceki madde9. Her ne kadar yeni tedavi hedefleri keşif için iyon kanal protein anahtar rolü kabul edilmiştir, BLI üzerinde dayalı iyon kanal proteini-küçük molekül etkileşim tahlil tarif değil.
İnsan eter à go- kanalları (hEAG1) kanser hücrelerinin ve merkezi sinir sistemi birçok kanser ve nöronal bozuklukları10,11, kanal a potansiyel terapötik hedef kılan çeşitli dile getirdi 12,13,14. Laboratuarımızın Elektrofizyolojik çalışmada phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) hEAG1 kanal15üzerinde inhibitör etkisi onaylamıştır. İyon kanal proteini-küçük molekül bileşik etkileşimi özellikle belirli ligandlar eksik kanalları için diğer türleri için bir model olarak alma tekniği kullanarak hEAG1 ile etkileşim olabilir doğrudan PIP2 test sonuçlarımız temel. Saçınıza tahlil talimatlara hEAG1 protein biotinylated hazırlanan ve onları etkisiz hale streptavidin (SA) yüzeyinde Biyoalgılayıcı ipuçları etkileşim tarafından onları PIP2 çözümleri arasında doğrudan kendi bağlama gözlemlemek için takip protein ve lipit. HEAG1 protein kaplı yüzey, yüzey tabakasının kalınlığı PIP2 eki artırır sonra hangi doğrudan spektral shift ilişkili olan ve gerçek zamanlı16‘ ölçülebilir. Bağlama Kinetik Derneği adım olumlu bir kayma ve ayrılma adım negatif bir kayma nedeniyle belirlenebilir. Bu ilkeye göre biz vitro fonksiyonel durumunu korumak için benzeşme arıtma yöntemini kullanarak fonksiyonel hEAG1 iyon kanal proteini HEK-239T istikrarlı ifade sistemden arıtılmış sonra bağlama Kinetik ölçülen farklı konsantrasyon2PIP ve Elektrofizyolojik ölçümleri15dakika içinde gözlemlediği gibi bir semblable Kinetik veri vermiştir. Saçınıza sonuçlarından ve Elektrofizyolojik ölçümler arasındaki yakın ilişkiyi ilk kez BLI uygunluğu iyon kanal membran protein-küçük molekül etkileşim için uygun bir analitik araç olarak göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Membran iyon kanalları üzerinden %13 insan hastalıkları, kardiyovasküler ve nörolojik bozukluklar18de dahil olmak üzere çeşitli tedavi için şu anda bilinen ilaçların birincil tedavi hedefi olarak doğrulanmıştır. Yama-kelepçe, kayıt iyon kanalları ile küçük moleküller, fonksiyonel ölçmek için altın standart yaygın olarak kullanılan iyon kanal ligandlar için eleme. Ancak, küçük molekül diğer proteinler ve kanal ile etkileşim hücreler arası yollar üzerinde hare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser biyo-ID Center ve tıp ve mühendislik (YG2016QN66), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31271217) ve ulusal temel araştırma programı Çin (2014CB910304) SJTU disiplinler arası araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?. Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
