Électrophorèse sur gel en 2 dimensions
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Overview
Électrophorèse bidimensionnelle (2DGE) est une technique qui peut résoudre des milliers de molécules d’un mélange. Cette technique implique deux méthodes distinctes de séparation qui ont été accouplés : isoélectrofocalisation (IEF) et sodium dodécyl sulfate sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Ceci sépare physiquement composés à travers deux axes d’un gel de leurs points isoélectriques (une propriété électrochimique) et leurs poids moléculaires.
La procédure dans cette vidéo couvre les principaux concepts de 2DGE et une procédure générale pour caractériser la composition d’une solution complexe de protéine. Trois exemples de cette technique sont indiqués dans la section applications, y compris la détection des biomarqueurs pour l’initiation de la maladie et de progrès, suivi de traitement chez les patients et l’étude des protéines suite à une modification post-traductionnelle (PTM).
Deux dimensions, ou 2D, électrophorèse de gel est une technique utilisant les deux méthodes de séparation distincte qui peuvent séparer les milliers de protéines à partir d’un mélange unique. Une des techniques, SDS-PAGE ou le sodium dodecyl sulfate sur gel de polyacrylamide, ne peut pas complètement séparer des mélanges complexes. Électrophorèse sur gel 2D couples le SDS-PAGE à une deuxième méthode, isoélectrique se concentrant ou IEF, qui sépare basé sur les points isoélectriques, permettant la résolution de potentiellement toutes les protéines dans une cellule de lysat. Cette vidéo va montrer que les principes de la 2D gel électrophorèse, une procédure générale et certaines de ses applications biomédicales.
Électrophorèse sur gel 2D commence par IEF comme la première dimension. Chaque protéine a une valeur de pH, appelée point isoélectrique ou pI, où la charge nette est nulle. Lorsqu’une protéine est soumise à un champ électrique, elle se déplacera vers l’électrode de charge opposée. Échantillons d’intérêt sont chargés sur gradient de pH immobilisé, ou des IPG, les bandes qui ont incorporé des ampholytes, molécules contenant des groupes acides et basique. Un champ électrique est ensuite appliqué à la bande de gradient de pH, causant les protéines à migrer jusqu’à atteindre la valeur du pH correspondant à leur pI, où ils perdent leur charge nette.
Avant d’exécuter la seconde dimension, les protéines incorporées sont traités avec le SDS, leur dénaturation et fournissant une charge négative uniforme. Une fois terminé, les bandes IPG sont placés sur un gel de polyacrylamide. Un champ électrique appliqué attire les protéines vers l’anode, avec les plus grandes protéines se déplaçant plus lentement à travers le gel.
Une fois le mélange de protéines a été séparé selon pI et poids moléculaire, la carte du protéome est visualisée à l’aide de taches, et les protéines d’intérêt sont identifiées.
Maintenant que nous avons discuté des principes de l’électrophorèse sur gel 2D, Let ‘ s go sur une procédure de laboratoire typique.
Que l’expérience puisse être effectuée, les protéines doivent être solubilisées dans les médias. La solubilisation de l’échantillon est obtenue en additionnant des protéines avec une combinaison d’agents chaotropiques pour perturber les interactions hydrogènes, détergents non ioniques pour empêcher la modification des frais des protéines, agents réducteurs pour briser les liaisons disulfure et met en mémoire tampon. Pour enlever les protéines abondantes interférentes et autres molécules, le matériel est séquentiellement extrait par centrifugation et collection de la pastille qui en résulte ; suivi du traitement par l’endonucléase, enzyme utilisée pour consommer tout ADN qui interférerait avec l’expérience.
Une fois que les protéines ont été solubilisés, bandes IPG sont préparés en rinçant avec une solution de nettoyage de bande et laissés sécher à l’envers. Chaque bande est alors attribué un numéro de titulaire de la bande. Une fois prêt, l’extrait cellulaire est chargé sur les bandes dans un lent mouvement coulissant partir du négatif à l’extrémité positive. Dans le but de réhydratation, papier buvard humide est placé sur le dessus de l’électrode et sous les bandes de gel ; les bandes IPG sont alors bordés sur l’instrument de l’IEF. Un fort courant électrique est appliqué, et les protéines commencent à migrer.
À l’issue de la première dimension, le gel SDS-page est préparé dans un appareil de coulage. Les bandes IPG sont traités en les plaçant face vers le bas dans le tampon d’équilibration contenant du SDS. L’appareil d’électrophorèse est peaufiné avec addition de tampon d’électrophorèse. Les bandes IPG traitées sont recueillies à l’aide de la pince à épiler, posé sur les plaques de gel et scellé avec une solution d’étanchéité d’agarose. Une source de tension puis applique un champ électrique, qui se tient jusqu’à ce que les protéines plus rapide de terrassement sont à 1 cm du bas du gel.
A l’issue de l’électrophorèse, les protéines doivent être visualisées. Traditionnellement, ceci est réalisé par coloration au bleu de Coomassie bleu ou argent nitrate. Protéines d’intérêt peuvent être transférées depuis le gel et analysés par l’analyse par Western blot.
Une deuxième approche d’identification implique l’excision des protéines du gel, digérant, que leur analyse par spectrométrie de masse.
Maintenant que nous avons passé en revue une procédure, nous allons étudier certaines des utilisations pour électrophorèse 2D.
Une des utilisations plus courantes de cette technique est l’identification des molécules impliquées dans la progression et l’initiation de la maladie. Électrophorèse de gel 2D, couplée à la spectrométrie de masse, peut détecter l’ou vers le bas-régulation des protéines spécifiques dans les zones malades par rapport à celles qui sont saines.
En outre, électrophorèse 2D est utile pour suivre le progrès de la réponse des patients à un médicament thérapeutique potentiel. Spécimens peuvent être prises chez les patients à différents intervalles après l’administration du traitement. De cette façon, électrophorèse 2D couplée avec la tache occidentale ou l’analyse de spectrométrie de masse, peut détecter des protéines associées aux réponses négatives telles que l’inflammation ; ou l’absence de protéines dans un État allégé.
Un autre usage pour électrophorèse 2D est l’étude de la structure des protéines et la fonction après modification post-traductionnelle ou PTM, qui sont des ajouts aux protéines suite à leur traduction de l’ARNm. PTM peut réglementer une variété de fonctions, y compris les protéines de signalisation, l’expression des gènes, ou causer des dommages oxydatifs. Électrophorèse de gel 2D est sensible aux modifications telles que la méthylation ou acétylation, qui peut provoquer un changement dans la pI ainsi que le poids moléculaire.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE par électrophorèse sur gel 2D. Cette vidéo décrit les principes de la technique, une procédure expérimentale typique et plusieurs de ses applications dans le domaine de la biomédecine.
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Procedure
Disclosures
Transcript
Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let’s go over a typical laboratory procedure.
Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins’ charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients’ response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM’s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
You’ve just watched JoVE’s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
