Etiquetado metabólico
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Overview
Etiquetado metabólico se utiliza para probar las transformaciones bioquímicas y modificaciones que ocurren en una célula. Esto se logra mediante el uso de análogos químicos que imitan la estructura de biomoléculas naturales. Las células utilizan análogos en sus procesos bioquímicos endógenos, produciendo compuestos que están etiquetados. La etiqueta permite la incorporación de la detección y etiquetas de afinidad que pueden utilizarse para aclarar las vías metabólicas mediante otras técnicas de análisis bioquímicos, como SDS-PAGE y RMN.
Este video presenta los conceptos de etiquetado y mostrar dos generales procedimientos metabólicos. La primera utiliza etiquetado isotópico, para caracterizar la fosforilación de una proteína. La segunda cubre un etiquetado fotoreactivas para caracterizar la interacción proteína-proteína dentro de un también tres aplicaciones de etiquetado metabólico presentan: etiquetado de material vegetal, etiquetado RNA para medir la cinética y glicanos en el desarrollo de embriones.
Etiquetado metabólico se utiliza para investigar la maquinaria de una célula. Esto se logra utilizando químicos análogos para las transformaciones bioquímicas y modificaciones que se producen. Este video le mostrará los principios de etiquetado metabólico, típico isotópica y fotoreactivas etiquetado procedimientos y aplicaciones.
Etiquetado metabólico puede realizarse mediante una serie de estrategias. Aquí describiremos etiquetado isotópico, fotoreactivas y bio-ortogonales.
Etiquetado isotópico se realiza utilizando análogos estructurales que son químicamente idénticos a sus contrapartes naturales, pero han incorporado isótopos poco comunes en su estructura. En este análogo de L-lisina se reemplazan los átomos de carbono y nitrógeno con carbono 13 y nitrógeno-15. Las células cultivadas en presencia de análogos isotópicos incorporen a sus estructuras bioquímicas. Metabolitos son recogidos de las células y purifica para el análisis. Las muestras con los isótopos estables se analizan mediante técnicas como la espectrometría de masas o espectroscopia NMR. Las muestras con etiquetas radiactivas se analizan utilizando películas de centelleo líquido contando y rayos x, lo que se demostrará en el protocolo de etiquetado isotópico.
Etiquetas fotoreactivas son grupos funcionales incorporados en las proteínas, que son estables hasta que expuesto a la luz ultravioleta. El grupo funcional forma a un radical reactivo, que se une a la proteína más cercana. Un ejemplo común, Foto-L-leucina, contiene un anillo diazirine, que es un crosslinker fotoreactivos. En contraste con etiquetado isotópico, hay algunos químico desemejanza entre foto-reactivos químicos análogos y sus contrapartes naturales. Las células pueden incorporar preferentemente compuestos naturales sobre análogos. Por lo tanto, es importante realizar etiquetado foto-reactivo en el medio libre del compuesto que mímico. Una vez expuesto a la radiación ultravioleta, los grupos foto-reactiva en una proteína marcada se convierten en inestable y altamente reactiva, haciendo que reaccione con las proteínas obran recíprocamente, creando una proteína compleja. Los complejos reticulados, actúan como instantáneas que luego pueden ser analizadas utilizando SDS-PAGE y los métodos de espectrometría de masas. Esto proporciona penetraciones en qué reacciones se producen en la vía metabólica mediante la identificación de especies de la reacción y cómo interactúan en la determinación de sitios de Unión.
Etiquetado estrategias de Bioorthogonal utilizan análogos con pequeños grupos funcionales que no tienen poca o ninguna reactividad con biomoléculas naturales. Por ejemplo, azidas son pequeños grupos funcionales, cuya reactividad se dice que es ortogonal a las reacciones bioquímicas. En la ligadura de Staudinger, un grupo de fosfino ataca el grupo azido. Esto produce un estado de transición que intramolecularly reacciona con un éster cercanos, dando por resultado un ligando amina-consolidado. Grupos funcionales de Bioorthogonal incorporados en biomoléculas pueden ligarse con las etiquetas de detección tales como fluorescentes grupos funcionales, y afinidad etiquetas como antígenos.
Ahora que se han discutido algunos conceptos y estrategias para el etiquetado metabólico, veamos el proceso en el laboratorio.
El primer paso en un experimento etiquetado metabólico es recoger la proteína de interés. Para ello, las células se cultivan en un plato, y se utiliza un método de expresión para promover la síntesis de la proteína deseada. En este ejemplo, quinasas repetición rica en leucina o LRRK, expresan. Fosfato disódico, que contiene fósforo-32 radioactivo, es utilizado como la analógica. Deberán tomarse las medidas adecuadas para proteger contra las radiaciones ionizantes. Esto incluye la creación de un área de trabajo, usando equipo de protección adecuado y comprobación de contaminación radiactiva. Una vez que se han tomado medidas de seguridad, el medio que contiene los isótopos análogos está preparado. El medio de la cultura es eliminado y reemplazado con uno que contiene los isótopos químicos análogos y luego se incubaron. Tras la incubación, las células son sometidas a lisis. El lisado es recogido y purificado.
Después de la purificación, las proteínas se resuelven utilizando SDS-PAGE y luego se transfiere a una membrana PVDF. Autorradiografía se realiza exponiendo la membrana para la película de rayos x y mide usando a un sensor de fósforo. Western Blot se utiliza para medir niveles relativos de la proteína en la membrana PVDF. En este ejemplo los niveles de fosforilación de ricos en leucina repetición quinasas sintetizan en midieron las células 293T. Cuánto fósforo se muestra en el autoradiogram fue incorporado en la proteína. El borrar occidental aclara los niveles de las proteínas LRRK. Software de análisis de imagen se utiliza para obtener datos cuantitativos de los niveles de fosforilación de las proteínas.
En este procedimiento siguiente, etiquetado fotoreactivas es demostrado. En primer lugar, las células son preparadas y cultivadas. El análogo fotoreactivos es añadido a las células en la fase de registro medio y se incubaron. En este procedimiento se utiliza p-benzoylphenylalanine. Las muestras se recogen sobre intervalos y puesto en el hielo. Las muestras se exponen para obtener instantáneas de las vías bioquímicas con el tiempo. Las proteínas de interés son entonces purificaron y resuelven mediante SDS-PAGE.
Se utilizó una estrategia etiquetadora fotoreactivas para identificar compuestos que interactúan con la proteína de interés. Inmunodetección con Western Blot bandas de proteínas muestra que indican mayor peso molecular las proteínas están presentes en las muestras irradiadas. Estas son de cross-linking debido a la interacción de proteínas que se producen durante la irradiación UV.
Ahora que hemos analizado los procedimientos Etiquetadoras metabólicos, echemos un vistazo a algunas de las formas que es utilizar el proceso.
Conceptos Etiquetadoras metabólicos pueden ampliarse a los organismos multicelulares. Plantas se cultivan en un ambiente sellado, ricas en isótopos estables para material vegetal producido de etiquetado. Dióxido de carbono con carbono-13 se añade al recinto, mientras que el nitrógeno-15 se usa fertilizante rico. El material resultante de la planta cosechada puede ayudar a responder preguntas sobre el carbono y nitrógeno ciclo del ecosistema.
Etiquetado permite la separación del ARN recién sintetizado del ARN más viejo. Cambiando la concentración inicial de análogo, se puede determinar la cinética de la nueva síntesis de ARN. Los resultados muestran que la concentración de 4-thiouridine afecta a la cuanta nuevo RNA se transcribe. Además, las tasas de incorporación de la etiqueta en el RNA se pueden cuantificar directamente con un espectrofotómetro.
Mediante la química del tecleo de biorthogonal, puede etiquetarse glycans en un embrión de pez cebra. Los huevos son inyectados con un producto etiquetado que resulta en las etiquetas de alquino de los glicanos. Los glicanos de las larvas se unen entonces a un compuesto del tinte en la etapa de desarrollo deseado. Entonces son imágenes de los glicanos en los embriones. Glycans producidos en diferentes puntos temporales pueden identificarse por etiquetado utilizando diferentes colores en las diferentes etapas del desarrollo embrionario.
Sólo has visto video de Zeus en el etiquetado metabólico. Este video describe los conceptos de etiquetado metabólico y sus estrategias, pasó dos procedimientos generales y había cubierto algunos de los usos de las técnicas.
¡Gracias por ver!
Procedure
Disclosures
Transcript
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
Now that we’ve reviewed metabolic labeling procedures, let’s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
You’ve just watched JoVE’s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
