Identifikasjon av OTX1 og OTX2 som to mulig molekylære markører for Sinonasal kreftsvulster og Olfactory Neuroblastomas

Summary

Homeobox gener er regulatory gener ofte assosiert med svulster i voksen organismer. Vi undersøkt deres komparative uttrykk av immunohistochemical og sanntid PCR analyse, normal og provoserende nasal mucosae og sinonasal neoplasms for å bruke dem som mulige diagnostiske og terapeutiske mål.

Abstract

OTX homeobox (HB) gener som er uttrykt i løpet embryonale morphogenesis og under utviklingen av olfactory epitel i voksen organismer. Mutasjoner som forekommer i disse genene er ofte knyttet til tumorigenesis i menneskelig. Ingen data er tilgjengelig i dag om mulig sammenheng mellom OTX gener og svulster av nesehulen. Formålet med dette arbeidet er å forstå hvis OTX1 og OTX2 kan betraktes som molekylære markører i utviklingen av nese svulster. Vi valgte nese og sinonasal adenocarcinomas undersøke uttrykk for OTX1 og OTX2 gener gjennom immunohistochemical og sanntid PCR analyser. Både OTX1 og OTX2 var fraværende i alle prøvene av sinonasal Intestinal-Type Adenocarcinomas (ITACs). OTX1 mRNA ble identifisert i ikke-tarm Type Adenocarcinomas (NITACs) mens OTX2 mRNA ble uttrykt i Olfactory Neuroblastomas (ONs). Vi har vist at den differensial genuttrykk for både OTX1 og OTX2 gener kan være en nyttig molekylær markør å skille ulike sinonasal svulster.

Introduction

OTX HB gener er den virveldyr homologue av Drosophila orthodenticle genene (otd) og de kode for transkripsjonsfaktorer som uttrykkes vanligvis under embryonale morphogenesis, men de kan også uttrykkes i voksen organisme med ulike funksjoner . Under embryonale utviklingen kontrollere de spesifikasjonen av cellen identitet, celledifferensiering og posisjonering av kroppen axis¹. OTX familien inkluderer OTX1 og OTX2 gener som viser ulike funksjoner. OTX1 er involvert i hjernen og sensoriske orgel utvikling. Voksen organismen, det uttrykkes i sensoriske organer og er transkribert på lave nivåer i fremre flik av hypofysen²; Det spiller også en rolle i hematopoiesis, uttrykt i blodkreft pluripotent og stamfar celler³. OTX2 er involvert i utviklingen av rostral hodet og dens oversatt protein fungerer som en morphogen fordi den genererer en forløpning gjennom hvilke andre gener er aktivert eller undertrykt på en spatio-temporale måte, noe som bidro til celle spredning og differensiering. I voksen organismen, er OTX2 funnet i choroid plexus og pinealkjertelen⁴.

Mutasjoner i OTX gener er ofte knyttet til visningen av menneskelig medfødt, somatiske eller metabolske mangler. Vinning mutasjoner i OTX gener kan fremme tumorigenesis hvis de ikke kunne kontrollere riktig mobilnettet vekst og/eller differensiering⁵. I leukemias og lymfomer så vel som mange solide tumorer (f.eks medulloblastomas⁶, aggressive non-Hodgkin lymfomer², bryst kreftsvulster⁷, kolorektal kreft⁸og retinoblastoma⁹), den deregulert uttrykk for OTX HB gener er godt dokumentert¹⁰. I tillegg har OTX2 mutasjoner blitt vist i tilfeller av anophthalmia og microphtalmia¹¹ på grunn av avgjørende rollen for dette genet i kontroll av øye utvikling.

I forbindelse med solid neoplasms er oppdagelsen av molekylære og fenotypiske markører en viktig utfordring for diagnose, klassifisering og behandling av flere typer av svulst¹¹, inkludert de som kommer i nesehulen og paranasal bihulene. Faktisk, til tross for at disse områdene okkupere bare en beskjeden anatomiske plass, mucosal epitel, kjertler, myke vev, bein, brusk eller nevrale/neuroectodermal, og hematolymphoid celler kan ofte stedet for opprinnelsen til komplekse og histologisk forskjellig grupper av svulster. Ulike typer neoplasms som involverer sinonasal skrift presenterer en rekke funksjoner som overvinne hva er vanligvis sett i øvre aerodigestive skrift eller selv i de fleste deler av kroppen¹². Sinonasal malignitet er sjeldne og presentere en årlig forekomst av 1:100,000 innbyggere over hele verden, og så dette hindrer studier om veier tumorigenesis og testing av alternativ behandling strategier. Til tross for dette, fremskritt i imaging teknikker, har kirurgiske metoder, og strålebehandling forbedret klinisk forvaltning av sinonasal kreft. Videre utvikling av linjer som dyremodeller og kreft genetisk profilering for tiden utgjør grunnlaget for fremtidige målrettet anticancer terapi¹³. Hittil er det ingen rapporter om OTX1 og/eller OTX2 uttrykk i neoplasms av nesehulen, paranasal bihulene og nasopharynx. Siden vi har tidligere observert at OTX1 og OTX2 er involvert i bryst kreft⁷, lurte vi hvis disse genene kan finnes ikke bare i den normale nasal mucosa, men også i svulster av nesehulen. Å nå dette målet vi innhentet fra avdeling for patologi på “Ospedale di Circolo” i vareprøver av normal mucosa og nese og sinonasal adenocarcinomas samlet fra 1985 til 2012 og klassifisert i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) klassifisering av hodet og halsen svulster. Vi vil analysere dem gjennom sanntids PCR og immunohistochemistry analyser og vi vurdert OTX1 og OTX2 uttrykk for å finne ut om de kan betraktes molekylære markører for disse typer av svulst.

Protocol

Alle studier ble utført ifølge erklæringen av Helsinki (1975) med skriftlig samtykke og godkjent av den etiske komiteen Insubria University i Varese. 1. innsamling av prøvene Samle inn og dele alle menneskelige Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) prøvene i forskjellige undergruppene ifølge WHO klassifiseringen av hodet og halsen svulster14.Merk: Her vi brukte følgende prøver: Normal sinonasal mucosa som kontroll (10 prøver); I…

Representative Results

I normal mucosa observerte vi sterke og homogen kjernefysiske reaktivitet for OTX gener i tungeformet pseudostratified åndedretts-type epitel og i de submucosal kjertler cellene (figur 1A). Vi fant kjernefysiske uttrykk for OTX1 i alle NITACs prøver (figur 1B), mens liten eller fraværende immunoreactivity ble understreket i ITACs (figur 1 c). Intens immunoreactivity var til stede i alle ONs (<stro…

Discussion

Denne studien viser for første gang som, basert på mRNA nivåer, HB gener OTX1 og OTX2 uttrykkes i normal sinonasal mucosa og submucosal kjertler, inflammatorisk polypper, sinonasal Schneiderian papillomas, og de forskjellige epitel og neuroectodermal neoplasms, inkludert squamous kreftsvulster, ikke-tarm type sinonasal adenocarcinomas, salivary kjortelen-type svulster, neuroendocrine neoplasms og ONs.

Endringer og feilsøking:

For å unngå RNA fornedrelse, utført …

Materials

RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799