Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Strømlinet 3D cerebellare differentiering protokol med valgfri 2D ændring

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/56888
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

Summary

Vi beskriver et forenklet 3D differentiering protokol for hPSCs, bruger defineret medium og reduceret vækstfaktorer, frembringe celle aggregater med tidlige neuroepithelial strukturer og positiv for cerebellare-associerede markører, samt en valgfri 2D modifikation for differentiere celler som en éncellelag til at generere funktionelle neuroner.

Abstract

Reducere kompleksiteten og omkostningerne ved differentiering protokoller er vigtig for forskere. Denne interesse passer med bekymringer om mulige utilsigtede effekter at extrinsic mønstre faktorer kan indføre i humane pluripotente stamceller (hPSC) modeller af hjernens udvikling eller Patofysiologi, som f.eks masking sygdom fænotype. Vi præsenterer her, to cerebellare differentiering protokoller til hPSCs, designet med enklere start metode, færre mønstre faktorer, og mindre materielle krav end tidligere protokoller. For nylig har udviklet vi kultur procedurer, som skaber frit svævende 3-dimensionelle (3D) produkter i overensstemmelse med andre hjerne "organoid" protokoller, herunder morfologier relevante for modellering hjernens udvikling som sub/ventrikulær zone- og rhombisk læbe-lignende strukturer. Andet bruger en vedhængende, 2D éncellelag procedure til komplet differentiering, der er vist i stand til at generere funktionelle cerebellare neuroner, som produkter er positive for cerebellare-associerede markører, og udstille neuron-lignende calcium tilstrømning. Sammen, tilbyder disse protokoller forskere et valg af muligheder, der passer til forskellige forskningsformål samt en grundlæggende model for prøvning af andre strømlinet neurale differentieringer.

Introduction

In vitro protokoller for differentiere hPSCs mod cerebellare lineages oprindeligt drives på princippet om efterligne i vivo cerebellare udvikling1,2,3,4. Som sådan, krævede de en lang række faktorer indført på bestemte tidspunkter til at køre pro-cerebellare mønstre og modning. Chief blandt disse var WNT, ben morfogenetiske proteiner (BMP), og fibroblast vækstfaktorer (FGFs) med kendte roller i midten baghjernen udvikling og dannelse af isthmic organizer5,6,7. Selvfølgelig hver ekstra skridt og faktor betyder en stigning i arbejdskrævende manipulationer og større udgift for forskeren, og så udvikle enklere protokoller i stand til at opnå lige resultater er af interesse. Dette praktiske spørgsmål passer pænt med det hypotetiske spørgsmål, om cellerne kræver sådanne stramme, ekstern kontrol over deres udvikling i vitro.

Cerebellare differentiering rettet en protokol, der er offentliggjort i 2015 nødvendigheden af ved hjælp af en omfattende række vækstfaktorer ved hjælp af kun FGF2, FGF19 og stromale celle-afledte faktor 1 (SDF1) til mønster formål8. Denne undersøgelse også afveg fra forudgående cerebellare protokoller, ved hjælp af en frit svævende 3D kultur system. Ud over producerende celler positiv for cerebellare markører, blev hjernen "organoids" oprettet af deres teknik vist at udstille relevante morfologi, ikke tilgængelig i traditionelle 2D éncellelag kulturer, som rombeformede læbe-lignende strukturer. Selv om mindre komplicerede og bekostelige med hensyn til vækstfaktorer, andre funktioner såsom dannelsen af ensartet embryoid organer (EBs) og kultur i 96-brønd plader (96WPs), gjorde det proceduremæssigt komplekse under indledende skridt. En anden 3D protokol udgivet samme år, rapporterede vellykket differentiering til neurale lineages ved hjælp af fælles og billig celle kultur teknikker9. Selv om denne gruppe var at undersøge kortikale snarere end cerebellare differentiering, bør anvendelsen af deres koncept for cerebellare differentiering ikke diskonteres.

Vi har for nylig rapporteret en 3D cerebellare differentiering protokollen ved hjælp af et reduceret antal mønstre faktorer (nemlig, FGF2, 4 og 8), samt en forenklet setup ved at holde cellerne i 6-godt plader (6WPs) i hele at minimere medium krav10. For at hjælpe produktionen af granula celler, blev glittesinden agonist (SAG) brugt under trinnet endelige modning. SAG er en billigere kemiske alternativ til sonic hedgehog (SHH), som havde været anvendt i tidligere cerebellare protokoller, på grund af sin rolle i at fremme væksten af granulet celle prækursorer (GCPs) i vivo1,2, 11,12,13. Differentiering produkter var i overensstemmelse med dem fra andre 3D protokoller, herunder tilstedeværelse af cerebellare-associerede markører i morfologisk relevante strukturer8,9. Sådanne resultater styrke den tidligere meddelelse, der detaljeret mimicry i vivo miljø må ikke være nødvendig for komplekse 3D in vitro- differentiering protokoller.

Ud over 3D-protokollen, denne rapport beskriver en 2D protokol, designet med den samme hurtig opsætning, grundlæggende materialer, og reduceret antallet af vækstfaktorer. Det er i stand til at producere celler fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) eller induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), positiv for datamærker forbundet med tidligt neurale, cerebellare, og granulet celle identiteter. Derudover indikerer calcium imaging tilstedeværelsen af funktionelle menneskelige neuroner. Mulighed for at vælge mellem protokoller, tilføjer en grad af fleksibilitet for forskere, for der er interesseret i enten: (1) generere specifikke celle typer, (2) modellering menneskelige hjerne udvikling og tilhørende strukturer, (3) analyse optimeret i éncellelag indstillinger (f.eks., patch-clamp optagelser), eller (4) celle-celle interaktioner i blandet neurale kulturer. Deres enkle og prisbillige natur gør dem tilgængelige for forskere, der er nye til feltet hPSC, eller har brug for base hPSC procedurer at udforske yderligere differentiering indstillinger.

Protocol

1. præparater

Bemærk: Alle trin under Bordet af materialer til bestemte elementer.

  1. Forberede hPSC kultur 500 mL defineret hPSC næringssubstratet
    Bemærk: Brug medium for trin 2.1-2.6.
    1. Optø hPSC mellemstor supplement natten over (o/n) ved 4 ° C. Fjerne 12,5 mL af hPSC base medium fra mellemstore flaske, hvorefter der tilsættes 10 mL af supplement og 2,5 mL (fremstilling af 100 U/L) Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) til flasken.
    2. Opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for 2 uger.
      Bemærk: HPSC medium kan bruges til at fryse ned celler ved at tilføje 10 µM ROCK Inhibitor (RI) og 10% DMSO.
  2. Forberede differentiering kultur 1 L neurale vedligeholdelse medium (NMM)
    Bemærk: Brug medium for trin 3.1-4.4.
    1. Mix glutamin befæstet DMEM/F12 og neurale grundlæggende medium (1:1 ratio) i en 1 L flaske, derefter supplement med (1 x) N2 supplement, (1 x) B27 supplement, 5 µg/mL insulin, 1,5 mM L-glutamin, 100 µM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 100 U/L Pen/Strep og 10 µM Beta-mercaptoethanol.
    2. Opbevares medium ved 4 ° C og anvendes inden for 3 uger.
      Bemærk: Før du tilføjer kosttilskud til blandet basal medium, fjerne den passende lydstyrke til at justere for den krævede mængde ekstra komponenter baseret på lager koncentrationer.
  3. Forberede 500 mL 0,5 mM EDTA brugsopløsning til passaging hPSCs
    Bemærk: Brug medium for trin 2.4 og 2.5.
    1. Under en flow-hætte, overføre 49 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS) fra en 500 mL steril PBS flaske til en 50 mL tube. Tilføje 0,5 mL 0,5 M EDTA og 0,9 g NaCl til 50 mL tube. Bland forsigtigt at opløse.
    2. Filter-sterilisere løsning ved hjælp af et 0,22 µm filter og overførsel til 500 mL steril PBS flaske. Opbevares ved stuetemperatur (RT).
  4. Forberede hPSC kultur plader til hPSC kultur
    Bemærk: Brug plader for trin 2.1-2.6.
    1. Gøre 50 x brugsopløsning af hPSC-passende vedhængende belægning (PAAC): optø et hætteglas med PAAC o/n ved 4 ° C. Fortynd PAAC i forholdet 1:1 med DMEM/F12 og overførsel som 400 µL delprøver i 1,5 mL rør. Butik 50 x brugsopløsning PAAC ved-80 ° C.
      Bemærk: (vigtigt) PAAC størkner hurtigt på RT, det er derfor nødvendigt, at alle komponenter (DMEM, rør, osv.) opbevares på is (eller ved 4 ° C).
    2. Tø rør af 50 x brugsopløsning PAAC ved 4 ° C, så Fortynd 50 x i kolde DMEM/F12. Tilføje 750 µL/brønd af fortyndede PAAC til en 6WP. Inkuber plade i mindst 1 time ved 37 ° C.
      Bemærk: PAAC plader kan opbevares i 1 uge på 4 ° C, af indpakning pladen efter 1 h inkubationstid. Varm plade til 37 ° C før brug.
  5. Forberede differentiering kultur anti-klæbende (AA) plader
    Bemærk: Brug plader for trin 3.1-4.1.
    1. Gøre 5 mg/mL Poly (2-hydroxyethyl methylmethacrylat) (poly-HEMA) løsning i 95% Ethanol. Ryst o/n ved 37 ° C, indtil der opnås en klar løsning. Butik på RT.
      Bemærk: Filtrering gennem et 0,22 µm filter kan fjerne uopløst poly-HEMA.
    2. Føje poly-HEMA til kultur plade, så det dækker bunden af hver brønd. Inkuber plade ved 37 ° C i 2 dage, og inspicere plade for at sikre en komplet fordampning af flydende/ensartet belægning af brønde. AA plader kan indpakket og opbevaret på RT.
  6. Forberede differentiering kultur Poly-L-ornithin/Laminin (PLO/LAM) plader
    Bemærk: Brug plader for trin 4.2-4.4.
    1. Frakke overfladearealet af brønde, ved hjælp af 20 µg/mL PLO opløst i steril PBS. Inkuber plade o/n ved 37 ° C. Opsug PLO og skyl 3 gange med PBS.
      Bemærk: (Valgfrit) Incubated plade med PLO kan indpakket og opbevares ved 4 ° C indtil det skal bruges.
    2. Coat overfladen områder af PLO-coatede brønde, ved hjælp af 10 µg/mL LAM opløst i steril PBS. Inkuber i mindst 2 timer ved 37 ° C eller o/n ved 4 ° C. Fjerne LAM og vask brønde 2-3 x med PBS, derefter straks tilføje passende medium og/eller celler.
      Bemærk: (Valgfrit) fjernet LAM løsning kan opbevares ved 4 ° C og genbruges op til 2 gange. (Vigtigt) Tillad ikke LAM-belagt overflader til at udtørre; for at undgå dette straks tilføje PBS eller passende medium.
       

2. protokol 1: Feeder-fri hPSC kultur

Bemærk: hESCs blev indhentet fra en ikke-kommerciel organisation (linje H01, se Tabel af materialer). Tre hiPSC kontrol linjer (hvs51, 60 og 88) blev genereret af omprogrammering fibroblaster fra tre sunde menneskelige patienter (fibroblaster var afledt fra anonyme, ikke-identificerbare donorer og derfor undtaget fra IRB godkendelse)10, 17.

  1. Opretholde hPSCs i feeder-fri kultur
    1. Efter optøning og plating hPSCs på PAAC plader i hPSC medium (Se trin 2.2), opretholde hPSCs ved 37 ° C med 5% CO2. Opdatere hPSC medium dagligt (Se trin 2.3), undtagen dagen efter optøning eller passaging og undersøge celler under mikroskop (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1) at observere vækst Vurder og identificere potentielle områder af differentiering (figur 3 , øverste venstre panel viser eksempel på differentiering).
    2. Passage hPSCs hver 3-4 dage, eller når kultur når > 80% sammenløb. Hvis mindre end 5% af cellerne udstille differentiering, brug normale hPSC passaging metode (Se trin 2.4), ellers kan du bruge metoden blid (Se trin 2.5). Når det ikke længere behøves i kultur, hPSCs kan indefryses for lang sigt opbevaring (Se trin 2.6).
  2. Optø hPSCs i hPSC medium
    1. Overfør den nødvendige mængde af hPSC medium til sterile rør til optøningen (9 mL/kryogene tube) og forberedt PAAC pladen til at modtage optøede celler. Supplere medium i begge rør med 10 µM RI.
    2. Hent cryotube fra LN2 opbevaring og sted direkte ind i et vandbad (37 ° C). Når kun en lille is krystal rester, fjernes fra vandbadet og overføre indholdet af kryogene røret til tube til optøning proces (total volume 10 mL). Centrifugeres tube på 290 x g i 5 min på RT.
    3. Bruge en serologisk pipette til at fjerne PAAC løsning fra wells af PAAC pladen (Se trin 1.4) beregnet til at modtage celler, og tilføje hPSC medium med 10 µM RI.
      Bemærk: (vigtigt) gør ikke aspirat PAAC løsning med en suge nål, eller det kan størkne og tilstoppe linjer til vakuumpumpen.
    4. Fjern supernatanten fra røret og resuspend celler i hPSC medium med 10 µM RI. Distribuere celler til destination pladen på forholdet mellem 1 kryogene tube/brønd af 6WP. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2, og ikke opdatere medium for 1 dag.
      Bemærk: Opstart af celler på 5% O2 kan øge celle overlevelse.
  3. Opdater hPSC medium
    1. Varm den nødvendige mængde af hPSC medium i sterile rør på RT eller i et vandbad; 2 mL/brønd af 6WP foreslås.
      Bemærk: (Valgfrit): ved at tilføje et ekstra beløb på hPSC medium, hPSCs kan forblive en ekstra dag uden forfriskende; men lad ikke dette mere end en gang om ugen.
    2. Opsug medium fra brønde indeholdende hPSCs og tilføje frisk hPSC medium.
    3. Kultur hPSCs i et varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.
  4. Passage hPSCs i hPSC medium
    1. Overfør den nødvendige mængde af hPSC medium til sterile rør, for passaging proces og forberedelse af PAAC plade til at modtage passaged celler. Supplere medium for destination plade med 10 µM RI. Varm de medium rør på RT eller i et vandbad.
      Bemærk: Forberedelse og håndtering varierer, hvis ved hjælp af en alternativ belægning materiale end angivet i Tabel af materialer.
    2. Bruge en serologisk pipette til at fjerne PAAC løsning fra wells af PAAC pladen (Se trin 1.4) beregnet til at modtage celler, og tilføje hPSC medium med 10 µM RI.
      Bemærk: (vigtigt) gør ikke aspirat PAAC løsning med en suge nåle, størkner og tilstopper linjer til vakuumpumpen.
    3. Opsug medium fra brønde med hPSCs for at være passaged, vaske cellerne to gange med 0,5 mM EDTA, derefter tilføje 0,5 mM EDTA og inkuberes i 2-5 min ved 37 ° C.
      Bemærk: 1 mL/brønd af 6WP er en tilstrækkelig mængde af EDTA til vask og inkubation.
    4. Kontrollere brønde under mikroskop (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hvis celler begynder at løsne, Aspirér EDTA-oploesning og flush celler gratis ved hjælp af hPSC medium.
      Bemærk: (vigtigt) Vær forsigtig ikke at fjerne hele hPSC kolonier, når sugning EDTA (Vent ikke, indtil hele kolonier afmontering). Ikke blive rød i kammen celler mere end 5 gange som dette kan skade hPSCs og pluripotency. Også, lad ikke celler stå i hPSC medium med RI før skylning celler fra brønde, så de igen kan overholde pladen.
    5. Baseret på empiriske bestemmelse (normalt relateret til sammenløbet, størrelsen af kolonier og vækst sats), overføre hPSCs til pladens huller destination ved hjælp af en opsplitning forholdet 1:4-1:16 (dvs., 1 godt fra den originale plade 4 brønde på destinationen plade). Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2, og ikke opdatere medium for 1 dag.
      Bemærk: Opdele nøgletal så høj som 1:16-1:20 er muligt at forhindre fortrængning og forbedre udseendet af kolonier.
  5. Passage hPSCs ved hjælp af blide-metoden (G-metode)
    1. Overfør den nødvendige mængde af hPSC medium til sterile rør, for den passaging proces og forberedelse af PAAC plade til at modtage passaged celler. Supplere medium for destination plade med 10 µM RI. Varm medium rør på RT eller i vandbad ved 37 ° C.
    2. Brug serologisk pipette til fjern PAAC løsning fra wells af PAAC plade beregnet (Se trin 1.4) til at modtage celler, og tilføje hPSC medium med 10 µM RI.
      Bemærk: (vigtigt) gør ikke aspirat PAAC med en suge nål, eller det kan størkne og tilstoppe linjer til vakuumpumpen.
    3. Opsug medium fra brønde med hPSCs at være passaged, og vaske cellerne to gange ved hjælp af 0,5 mM EDTA. På den anden vask, vent 30 s inden sugning EDTA, derefter tilsættes 1 mL PBS og inkuberes i 4-9 min. ved 37 ° C. Mens vi venter, forberede en steril tube med 4 mL PBS.
      Bemærk: 1 mL/brønd af 6WP er tilstrækkeligt volumen af EDTA til vask.
    4. Kontrollere brønde under mikroskop (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hvis celler er begyndt at løsne, tryk forsigtigt på sider af pladen til at hjælpe gratis kolonier. Når > 50% af kolonier er frit flydende, skal du bruge en 5 mL serologisk pipette til at overføre kolonier i 1 mL PBS til rør indeholdende 4 mL PBS (ikke hakkede).
      Bemærk: (vigtigt) Da formålet er at rydde op i hPSC kultur, check at afgøre, om differentierede celler forbliver knyttet til pladen. Også, det er ikke nødvendigt at passage alle kolonierne i en brønd med denne proces, så kolonier, der forbliver knyttet kan blive efterladt.
    5. Vent 5-10 min på RT for celler at bosætte sig i røret (ikke centrifugeres). Opsug PBS fra røret, pas på ikke for at fjerne udlignede hPSCs. Omhyggeligt resuspend celler i hPSC medium (ikke hakkede), og overføre cellerne til bestemmelsesstedet pladen ved hjælp af en opsplitning forholdet 1:4-1:16. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2, og ikke opdatere medium for 1 dag.
  6. Fryse ned hPSCs
    1. Alt efter sammenløbet, bruge 1 godt af hPSCs, 2-3 dage (maksimum) i kultur, at fylde 1-2 kryopræservering hætteglas til opbevaring i LN2.
    2. For enden af passaging (trin 2,5) anvendes 500 µL eller 1 mL af hPSC medium at overføre celler fra 1 godt af 6WP til 1 eller 2 kryopræservering hætteglas, henholdsvis (500 µL/vial). Hver tube, tilføje 500 µL af 2 x frysning medium indeholdende hPSC medium, 20 µM RI og 20% DMSO.
      Bemærk: (Valgfrit) celler kan overføres direkte i 1 x frysning medium på 1 mL/vial.
    3. Placer de kryogene rør i en kryogene container (indeholdende isopropanol) pre afkølet til 4 ° C, og butikken straks ved-80 ° C.
    4. Den næste dag, skal du overføre de kryogene rør til en LN2 tank til langtidsopbevaring.

3. protokol 2: 3D "Organoid" differentiering

  1. Opsætning af differentiering med modificerede G-metode til passaging af hPSCs
    1. Overføre NMM for antallet af destination wells krævede mængde til en steril tube. Supplere med 4 ng/mL FGF2 og 10 µM RI. Varm medium røret på RT eller i vandbad ved 37 ° C.
      Bemærk: Afhængigt af sammenløbet af originalmateriale brønde, hPSCs er koncentreret under distribution til destination pladen i et 2:1 eller 3:1 forholdet (dvs., 2 brønde fra den originale plade til 1 godt af destination plade), med en ende volumen af 2,5 mL/brønd af 6WP.
    2. Opsug medium fra brønde indeholdende hPSCs skal differentieres, og vaske cellerne to gange ved hjælp af 0,5 mM EDTA. På den anden vask, vent 30 s inden sugning EDTA, derefter tilsættes 1 mL PBS og inkuberes i 4-9 min. ved 37 ° C. Mens vi venter, forberede en steril tube med 4 mL PBS.
      Bemærk: 1 mL/brønd af 6WP er tilstrækkeligt volumen af EDTA til vask. (Vigtigt) Det er at foretrække at bruge hPSCs, der var ikke længere end 3 dage i kultur efter den sidste passage, og mindst 1-2 passager efter optøning.
    3. Kontrollere brønde under mikroskop (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hvis celler er begyndt at løsne, gratis cellerne af blid trykke på sider af pladen. Overfør celler til et rør, der indeholder 4 mL PBS med 5 mL pipette.
      Bemærk: (vigtigt) let rødmen og ændring er tilladt at bryde op kolonier og samle løs celler, men ignorere celler, der fortsat er overholdt på pladen.
    4. Give røret til at sidde i 10 min. ved RT, tyngdekraften adskillelse. Valgfrit, centrifugeres cellerne let (ikke er større end 200 x g på RT, for 5 min) hvis det kræves.
    5. Aspirat PBS fra røret, pas på ikke for at fjerne udlignede hPSCs, resuspend celler i NMM med 4 ng/mL FGF2 og 10 µM RI, og derefter distribuere til AA-belagt pladen i forholdet 2:1 eller 3:1. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2, og ikke opdatere mediet for 3 dage, medmindre det kræves (Se trin 3.2.1).
      Bemærk: (Valgfrit) For bekvemmelighed overføre celler, tilføje en del af dyrkningsmediet til pladens huller destination inden distribution og resuspend celler i en mindre volumen. HPSCs kan også, farves og tælles for at definere den nøjagtige start celle tæthed. Den endelige mængden i destination plade skal dog 2,5 mL/hul i 6WP.
  2. Vedligeholde frit svævende differentiering kultur ved 37 ° C (5% CO2)
    1. Kontrollere pladerne hver dag for ændringer i medium farve, ophobning af døde celler, sammenklumpning og overholdelse af nå bunde.
      1. Valgfrit: Uanset medium Skift tidsplan, opdatere (herunder de første 3 dage af no forfriskende) medium hvis det har vendt gule, og følg vejledningen til medium Skift/opdatering (trin 3.3). Hvis fleste celler vises døde, Følg instruktionerne for medium forandring/Opdater med tyngdekraften adskillelse (trin 3,4).
        Bemærk: Dannelsen af EBs og vækst i store celle aggregater forventes, men celler og celle aggregater kan klumper sig sammen i store masser ikke på grund af individuelle vækst/spredning. Hvis dette er observeret, er lys ændring at splitte masserne tilladt. Hvis celler begynder at overholde AA-plade overflade, kan de resterende flydende indholdet af brønde overføres direkte til nye brønde, eller overføres under processen med medium Skift/opdatering. Forsøg ikke at overføre celler, der har levet op til pladen.
    2. På dag 3, ændre mediet til NMM med 4 ng/mL FGF2. Opdater medium hver anden dag.
    3. På dag 7, ændre mediet til NMM med 1 µM retinoid syre (RA), 100 ng/mL FGF8B og 4 ng/mL FGF2. Opdater medium hver anden dag.
      Bemærk: (vigtigt) RA er lysfølsomt. Beskytte RA kultur prøver fra lys.
    4. Dag 14, ændre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 og 20 ng/mL FGF2. Opdater medium hver anden dag.
    5. På dag 17, ændre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B. Opdater medium hver anden dag.
    6. Dag 21, ændre mediet til NMM med 100 ng/mL hjernen afledt neurotrope faktor (BDNF) og 10 ng/mL Glial afledt neurotrope faktor (GDNF). Opdater medium hver anden dag.
    7. Dag 28, ændre mediet til NMM med 100 ng/mL BDNF og 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL neurotrope faktor 3 (NT3) og 25 mM KCl. Opdater medium hver anden dag.
    8. Dag 35, indsamle de 3D organoids til analyse.
  3. Ændring/Opdater differentiering medium for 3D kultur
    1. Overføre NMM krævede mængde med de passende komponenter (Se trin 3.2.2-3.2.7 for komponenten tidsplan) til en steril tube. Varme i et vandbad ved 37 ° C.
    2. Aflæsse pladen og Ryst forsigtigt indtil cellerne bilægge til bunden kanter af brøndene. Forsigtigt fjerne 2 mL af gamle medium ved hjælp af serologiske pipette, undgå fjernelse af celler, og derefter tilsættes 2 mL frisk medium. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
      Bemærk: (vigtigt) udgangen volumen skal være 2,5 mL/hul i 6WP. Hvis fordampning sker, må du ikke fjerne 2 mL af gamle medium som dette ville yderligere udtørre cellekulturer; i stedet tilføje ekstra medium.
  4. Ændring/Opdater differentiering medium med tyngdekraften adskillelse
    1. Overføre den krævede mængde NMM med de passende komponenter til en steril tube. Varme i et vandbad ved 37 ° C.
    2. Overføre indholdet af brøndene til en steril tube, og give røret til at sidde i 10 min. ved RT, tyngdekraften adskillelse.
    3. Bruge en pipette til at fjerne gamle medium fra røret, tager pleje ikke at fjerne afgjort celler, resuspend i NMM med passende komponenter, og derefter distribuere nye AA-coatede brønde. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
      Bemærk: (Valgfrit) For bekvemmelighed, en del af dyrkningsmediet kan blive tilføjet til destinationen wells forud for distribution, med differentiering celler genopslemmes i en lavere lydstyrke. Ende volumen skal være 2,5 mL/hul i 6WP.

4. protokol 3: Alternative 2D differentiering kultur

  1. Starte og vedligeholde kultur ved at bruge trinene som pr afdeling 3 3D protokol gennem dag 12
    1. Følg trin 3.1-3.2.3 og ændring/Opdater medium som pr trin 3.3 og 3.4.
  2. Skift til og fastholde som 2D éncellelag kultur
    1. Dag 13 af differentiering, Følg vejledningen for at ændre/Opdater medium med tyngdekraften adskillelse (trin 3,4), kun distribuere celler/aggregater til PLO/LAM belagt plade (Se trin 1,6) med en ende volumen af 2,5 mL/godt af 6WP.
      Bemærk: Medium kan suppleres med 10 µM RI under den indledende plating at hjælper tilslutning og overlevelse af celler. (Vigtigt) Det er ønskeligt at jævnt fordelt celler i brønde, undgå lav befolkningstæthed eller fortrængning på pladerne og passage (Se trin 4.4) efter behov. Den foretrukne størrelse af PLO/LAM overtrukne plader (dvs., 6WP, 12WP, etc.) skal bestemmes empirisk, baseret på spredning satsen for cellelinie, og formål for produktet. Vejledningen vil give diskenheder for 6WP, og kan blive konverteret af halvering for hver fordobling af godt nummer (dvs.2 mL/godt for 6WP, 1 mL/godt for 12WP, osv.)
    2. Dag 14, ændre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 og 20 ng/mL FGF2. Opdater medium hver anden dag som beskrevet i trin 4.3.
    3. På dag 17, ændre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B. Opdater medium hver anden dag som beskrevet i trin 4.3.
    4. Dag 21, ændre NMM mellemlang med 100 ng/mL BDNF og 10 ng/mL GDNF. Opdater medium hver anden dag som beskrevet i trin 4.3.
    5. Dag 28, ændre mediet til NMM med 100 ng/mL BDNF og 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL NT3 og 25 mM KCl. Opdater medium hver anden dag som beskrevet i trin 4.3.
    6. Dag 35, indsamle celler for analyse eller opretholde den samme medium som skridt 4.2.5 for udvidet kultur (potentielle grænse ikke testet).
  3. Ændring/Opdater differentiering medium for 2D kultur
    1. Overføre den krævede volumen af NMM med passende komponenter (Se trin 4.2.2-4.2.5 for komponenten tidsplan) til en steril tube. Varme i et vandbad ved 37 ° C.
    2. Opsug medium fra brønde, hvorefter der tilsættes 2 mL nyt medium. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
      Bemærk: (Valgfrit) udgangen volumen kan holdes på 2,5 mL/godt af 6WP, ved hjælp af en pipette til at fjerne 2 mL af gamle medium og tilsætning 2 mL af frisk medium. At reservere en del af gamle kan medium i brøndene, og at forhindre celler fra luften kontakt, mindske stød til cellerne under Skift trin.
  4. Passage 2D differentiering kultur
    1. Overføre NMM krævede mængde med de passende komponenter (Se trin 4.2.2-4.2.5 for komponenten tidsplan) til sterile rør, for passaging proces, og separat, for at forberede PLO/LAM belagt plade til modtagelse af passaged celler. Supplere medium af destination plade med 10 µM RI. Varm de medium rør på RT, eller i et vandbad ved 37 ° C. For at spare på komponenter, er det muligt at bruge NMM alene til at vaske cellerne under passaging processen.
      Bemærk: (vigtigt) hvis produkter vil blive brugt i calcium imaging eksperimenter, sikre, at passage celler mellem 2-6 dage før slutningen af differentiering.
    2. Opsug medium fra brønde til at være passaged. Tilføje 300 µL/brønd af trypsin-baserede dissociation agent (Se Tabel af materialer), swirl plade til at dække wells, derefter straks fjerne dissociation agent.
    3. Tillad plade til at sidde i 2 min. på RT, så løsne cellerne ved at trykke på sider af pladen. Tilføje 600 µL/brønd definerede trypsin inhibitor (DTI) og overføre cellerne i DTI til en steril tube med 5 mL NMM.
    4. Centrifugeres rør ved 290 x g i 15 min. ved RT. aspirat medium og tilføje en anden 5 mL NMM til røret.
    5. Centrifugeres rør ved 290 x g i 15 min. ved RT. aspirat medium og resuspend celler i den passende medium indeholdende RI.
    6. Distribuere celler på PLO/LAM pladen ved hjælp af en opsplitning forholdet 1:1-1:12, afhængigt af indledende sammenløb, spredning sats og størrelse forskellen i oprindelse til destination pladen, og fastholder ved 37 ° C med 5% CO2.

Representative Results

Visuel oversigt over nedsat vækst faktor 2D og 3D cerebellare differentiering protokoller
Figur 1 viser den generelle tidslinje for protokollerne 2D og 3D cerebellare differentiering identifikation af ydre faktorer og tidspunktet for plating. Den typiske fremskridt for hPSCs gennemgår 3D cerebellare differentiering er afbildet i figur 2: med menneskelige stamceller linje H01 starter som kolonier i feeder-fri kultur på dag 0 (øverste venstre hjørne af figur); gennemgår EB dannelsen af dag 2 (øverste midten); vokser i større celle aggregater med tilsyneladende lumen efter neurale induktion med RA og FGF8 på dag 14 (øverst til højre); danner aggregater af varierende størrelse og form på dag 28 (lavere venstre); udvikling i kompleksitet med forskellige strukturer i en enkelt samlet anført i dag 28 (lavere midten); og med fortsat morfologiske ændringer til de samme strukturer i dag 35 (nederst til højre). Den typiske fremskridt for hPSCs gennemgår 2D cerebellare differentiering er afbildet i figur 3: med menneskelige stamceller linje H01 som kolonier i feeder-fri kultur på dag 0 (øverst til venstre på figur, med cirkel med angivelse af området for differentierede celler blandt menneskelige stamceller kolonier) ; gennemgår EB dannelsen af dag 2 (øverste midten); vokser i større celle aggregater med tilsyneladende lumen efter neurale induktion med RA og FGF8 på dag 13 (øverst til højre); prolifererende som vedhængende celler efter plating på dag 14 (lavere venstre); og derefter som en éncellelag af celler med mere komplekse/modne morfologi i dag 35 under low (lavere midten) og høj forstørrelse (nederst til højre).

3D produkter udstille markører og strukturer af tidlige Neuroepithelium
Figur 2 (nederste venstre billedet) og figur 4 viser heterogenitet af 3D aggregerede morfologi set hele dyrkning, på grund af varierende vækst og/eller modning priser samt den stokastiske fletning eller bryde fra hinanden af aggregater. Trods heterogenitet producerer hver differentiering aggregater udstiller tidlige neurale og neuronal markører, herunder cerebellare granulet markør ZIC1, som angivet ved immuncytokemi (ICC) farvning i figur 5. Endnu vigtigere, tyder figur 5 og figur 6 på, at en simpel 3D kultur, med reducerede vækstfaktorer, er i stand til at generere aggregater med komplekse strukturer vedrørende hjernens udvikling som tidlig neuroepithelium og rombeformede læbe.

2D produkter udstille cerebellare markører og funktionelle Neuronal aktivitet
Mens 2D kulturer ikke kan reproducere komplekse 3D strukturer, er de i stand til at generere celler udstiller tidlige neurale og neuronal markører, herunder cerebellare granula celle markør ZIC1, som angivet af ICC farvning i figur 7. Gen expression analyse via RT-PCR, understøtter som det ses i figur 8, ICC farvning resultater, selv om tilstedeværelsen af tidlige granula celle markør ATOH1 er variabel mellem eksperimenter og linjer. Calcium imaging er mere let håndteres i 2D kultur. Som det ses i figur 9, supplerende Video 1og supplerende Video 2, viser elektrisk stimuleret celler calcium tilstrømning, der er typiske for neuronal affyring mønstre, tyder på generation af funktionelle neuroner.

Figure 1
Figur 1: tidslinje for differentiering protokol (startende fra dag 0 af differentiering). Solid line kasser angiver når specifikke faktorer føjes til substratet, og stiplede linje kasser angive plade-belægning for valgfri 2D ændring. For FGF2, pil ned henviser til lavere koncentrationer (4 ng/mL) og pil op henviser til højere koncentrationer (20 ng/mL). Dette tal er blevet ændret fra Holmes og Heine10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentant brightfield billeder af 3D protokol. menneskelige stamceller kolonier på d0, EBs på d2, aggregater efter induktion på d14, aggregater i forskellige størrelse og morfologi (nummereret 1-5) på d28, en enkelt aggregat med unikke og identificerbare funktioner (angivet med bogstaver en-c) på d28, og synlige ændringer i de samme funktioner på d35. Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Holmes og Heine10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant brightfield billeder i 2D protokol. menneskelige stamceller kolonier en d0, EBs på d2, aggregater efter induktion på d13, efter plating aggregater på d14, efter modning på d35, som det ses på 5 x forstørrelse og 20 x forstørrelse. Den hvide cirkel i øverste venstre panel viser området af differentierede celler blandt menneskelige stamceller kolonier. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Brightfield billeder viser varierende størrelse og kompleksitet i 3D kultur. Aggregater på (A) dag 8 (hESCs) og (B) d35 (hiPSCs). Sidstnævnte billedet består af tre separate billeder at vise hele samlede. Begge aggregater kan være blevet påvirket ved sammenlægning af mindre aggregater eller tab (afbryde) af strukturer. Skalalinjen = 200 µm. Dette tal er genudgives fra Holmes og Heine10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: ICC billeder af 3D produkter viser relevante markører og strukturer. På kultur d35, 3D produkter udstiller: PAX6 (grøn) og TBR2 (rød) af lumen af neurale roset-lignende formation (første række); DCX (grøn) og NeuN (rød) breder sig fra yderkanten ventrikulær zone (VZ)-lignende struktur (anden række); KIRREL2, en markør tilknyttet cerebellare neuroepithelium (tredje række, venstre); og ZIC1 en markør tilknyttet cerebellare granula celler (tredje række, højre). Eksperimentet blev udført flere gange ved hjælp af fire forskellige hPSC linier: menneskelige stamceller linje H01 (n = 5), og iPSC linjer hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), og hvs51 (n = 1). Pilene peger rombeformede lip (RL)-gerne struktur. Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er genudgives fra Holmes og Heine10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: stor skala ventrikulær zone-lignende struktur i 3D produkt. På kultur d35 er menneskelige stamceller-afledt samlet positive for PAX6 (grøn) og TBR2 (rød) ofte forbundet med tidlig neuroner findes inden for ventrikulær zoner (VZs) og subventricular zoner (SVZs), in vivo. (Top) En stjerne (*) markerer den apikale side af et VZ-lignende område kører langs kanten af samlet, med kantede parenteser angiver samtidig dybde/fordeling af VZ / SVZs. (midten) fusioneret signaler Vis spredte dele af PAX6 +/ TBR2-celler vokser i størrelse mod den øverste højre ende af VZ. (Nederst) Højere forstørrelse billede af afsnittet angivet af et rektangel i det midterste panel. Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Holmes og Heine10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: ICC billeder af 2D produkter viser relevante markører. På kultur d35, 2D produkter udstille, fra hESCs (øverste række) og hiPSCs (nederste række), celler positive for: granula celle markør ZIC1 og vandrende cerebellare neuron markør TAG1 (venstre kolonne); og neuronal markør neurofilament (NF) og TAG1 (højre kolonne). Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: RT-PCR 2D produkters. mRNA udtryk analyse af menneskelige stamceller linje H01 (øverste række) og hiPSC line hvs60 (nederste række) i slutningen af 2D protokollen viser produkter med gelelektroforese for: granula celle markør ZIC1, granula celle markør ATOH1, vandrende cerebellare neuron markør TAG1, Purkinje celle markør Calbindin (CALB), spænding-afhængige calcium kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminosmørsyre (GABA) B receptor 1 (G-Br1), og husholdning gen EIF4G2).

Figure 9
Figur 9: Calcium imaging/analyse af 2D produkter. På kultur d35, blev hPSC differentiering produkter optaget i 2 min. under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 farvestof. På 30 s, celler blev elektrisk stimuleret for 10 s på 10 Hz. (A) stillbilleder Vis hESCs på 0 s (venstre) og efter starten af elektrisk stimulation på 30 s (til højre). Pilene angiver region af interesse (ROI) for analyse af calcium tilstrømning. (B) grafisk analyse viser ændringen i relative fluorescens versus tid for ROI (ændre i fluorescens = (F-F0) f0, hvor F0 = (∑F1-n) / n), med neuron-lignende pigge sker før, under og efter stimulation. Sort bar angiver længden af elektrisk stimulation. Skalere bar (hvid) = 50 µm. fuld registrering for menneskelige stamceller (som ses her) og en hiPSC linje (ikke vist) er tilgængelige i supplerende Video 1 og supplerende Video 2, henholdsvis. Optagelser er i AVI-format, med 4 x hastighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Video 1: Calcium imaging video af 2D produkt fra menneskelige stamceller linje H01. På kultur d35, differentiering produkter fra menneskelige stamceller linje H01 blev optaget i 2 min. under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 farve. På 30 s, celler blev elektrisk stimuleret for 10 s på 10 Hz. optagelser blev lavet på 2 rammer/s, og forarbejdes til AVI video på ~ 7 rammer/s, producerer en video varighed ~ 30 s ~ 4 x hastighed. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Video 2: Calcium imaging video af 2D produkt fra hiPSC linje hvs51. På kultur d35, blev differentiering produkter fra hiPSC linje hvs51 optaget i 2 min. under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 farvestof. På 30 s, celler blev elektrisk stimuleret for 10 s på 10 Hz. optagelser blev lavet på 2 rammer/s, og forarbejdes til AVI video på ~ 7 rammer/s, producerer en video varighed ~ 30 s ~ 4 x hastighed. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Kompleksitet og omkostninger er relevante faktorer for stamcelleforskning forskere ved at vælge eller udvikle differentiering protokoller. Dette gælder især, da det er et åbent spørgsmål om hvor meget ekstern kontrol er nødvendige for at generere ønskede celletyper, eller — at udgøre det anderledes – hvordan kompetente hPSCs til at producere deres egen udviklingsmæssige miljø, hvis overladt til sig selv med tilstrækkelig næringsstoffer. Indførelsen af ydre faktorer i vitro kan meget godt producere ønskede celle produkter, men de kan også interferere med de iboende udviklingsmæssige kapacitet celler ville have udstillet i vivo. Sådanne overvejelser er vigtige, især hvis målet er brugen af patient-afledte iPSCs for sygdom modellering. Omfattende brug af mønstre og/eller vækstfaktorer kunne maskere sygdom fænotyper. De protokoller, der er beskrevet i denne betænkning følger udviklingen i tidligere undersøgelser til at reducere kompleksiteten, omkostningerne og/eller brug af ydre mønstre faktorer8,9.

Baseret på resultaterne rapporteres af Muguruma et al., og vores egne nylige undersøgelse, det ser ud til at det er muligt at opnå differentiering mod cerebellare skæbner uden en samordnet indsats at gengive i vivo betingelser, som tidligere undersøgelser har gjort 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. den spændende del er, at de to studier brugte forskellige sæt af vækstfaktorer, hvilket tyder på, at hverken sæt var nødvendig, selvom begge brugt FGF2. Vi kørte yderligere prøver, hvor FGFs blev selektivt udelukket fra protokollen, og viste, at celler var i stand til at generere de samme produkter uden ydre FGFs10. Forskelle mellem vores undersøgelser var kvalificeret ved, at vi brugte forskellige hPSC linjer og kultur metoder, induceret neurale differentiering med RA og omfattede komponenter til at understøtte granula celle overlevelse og modning (BDNF, GDNF, SAG og KCL)11 -14. Derudover blev en mindre komplekse start metode, sammenlignet med Muguruma et al., ansat. Deres protokol begyndte ved at generere ensartet EBs i 96WPs, hvilket afskar dem fysisk og kemisk fra hinanden. Protokol her havde alle PSC'er relativt stuvet sammen i 6WPs under EB dannelse, som tillod dem at kommunikere frit. Hvordan kan dette varierende har påvirket de fysiske og kemiske miljø af EBs og senere organoids (herunder iboende produktion af signalering forbindelser) er ukendt, og kan udforskes. Også, mens vi viser udtrykket af gener forbundet med — og så tyder på – cerebellare oprindelse, ligger inden for strukturer morfologisk ligner dem rapporteret af Muguruma et al., vi ikke kan udelukke generation af neuronal-lignende strukturer, er af ikke-cerebellare identitet. Fremtidige undersøgelser, ved hjælp af et stort panel af antistoffer som rapporteret af Muguruma et al. (dvs., ATOH1, CALB, osv.) ville gøre disse opgaver og sammenligning mellem produkter af begge protokoller, mere afgørende.

Inden for 3D-protokollen, det er vigtigt at starte med og opretholde et tilstrækkeligt antal celler i kultur til at sikre tilstrækkelig antal slutprodukter til analyse. Givet betydelige die-off tidligt i protokollen, anbefaler vi at starte med mere end 500 EBs/godt i de første 3 dage i kultur (figur 1). Dette bør ikke være svært at opnå en given koloni størrelser for hPSCs i feeder-fri kultur, men måske ikke være så let for dem, der stadig bruger feeder-afhængige metoder. I betragtning af det store antal celler, er det vigtigt at holde øje med farveskift i medium (med angivelse af pH-ændringer) og ophobning af døde celler. Begge skal rettes for at forhindre sammenbrud i kulturen. Der kan også være sammenklumpning af celler og aggregater i massive strukturer. Selv om det kan stadig resultere i aggregeringer, der kan analyseres, vil produktantal blive stærkt reduceret, så bryde dem i mindre aggregater med blid ændring kan være nyttige. Men undgå foruroligende normale aggregater, der selv kan vokse til store størrelser (figur 4). Hvis aggregater bliver alt for sparsomme, anbefales det at kombinere brønde, så aggregater ikke er helt isoleret. Produkt variation (i antal, størrelse og morfologi) er et velkendt problem i 3D cellekultur, herunder for de protokoller, begyndende med isolerede, ensartet EB dannelse trin, tyder på, at en mindre komplekse startprocedure (som protokol beskrevet her ) kunne være mere praktisk8,15. Mens denne heterogenitet er noget forskere skal holde sig for øje, navnlig under analysen, genereret rapporterede protokollen produkter i overensstemmelse med dem, der findes i andre 3D protokoller8,9,15. Baseret på størrelse og morfologi, falder de inden for intervallet af neurale roset til cerebral organoid, som beskrevet i en nylig gennemgang af Kelava og Lancaster15, med de mest passende klassificering af klumpformet. Særlig bemærkelsesværdig, er tilstedeværelsen af 3D strukturer tyder på neurale rosetter med lumen, (sub) ventrikulær zoner og rombeformede læbe ligesom funktioner (figur 5 og figur 6) som identificeret af andre grupper8 , 15 , 16 , 17. da hvert eksperiment produceret mindst én samlet med formodede VZ/SVZs og cerebellare-associerede markører (ZIC1, KIRREL2), dem er nyttige kriterier til bestemmelse af succes af en 3D differentiering ved hjælp af vores protokol, med RL-lignende funktioner, der giver ekstra støtte. Udvide varigheden af kultur sidste 35 dage blev ikke testet, men kunne forfølges for at bestemme det maksimale omfang af vækst, kompleksitet og modenhed tillader denne teknik.

2D-protokollen bruger de samme ikke-tilhænger EB dannelse og neurale induktion processen som 3D-protokollen og så den bemærkninger ovenfor gælder også. Når forgyldt, bør et andet sæt overvejelser overvejes. EBs bør overholde hurtigt for celler til at formere sig udad på pladen. Hvis der er problemer med tilslutning, tilsætning af RI (hvis ikke allerede bruges), reduceret omfanget af medium, eller eksperimentelle ændringer i PLO/LAM koncentration kan anvendes. Det er vigtigt at holde celler fra vokser alt for tætte eller sparsomme (helst voksne mellem 20-80% confluency) i brøndene; daglig overvågning og rettidig passaging er vigtigt, at undgå over-confluency eller flydende celler. I modsætning til 3D-protokol, bør der ikke være betydelig die-off under kultur, selvom der kan være områder med dårlig vækst, eller en opbremsning af spredning priser. Passaging påvirker tilstanden modning af celler (f.eks. fjernelse af celle processer og udviklede netværk mellem celler) og bør holdes for øje, når man nærmer sig punkter hvor celler vil blive indsamlet eller analyseres på anden måde. For eksempel, for calcium er imaging det meget vigtigt at passage celler mellem 2-6 dage før analyse. Passaging for tæt på kan analyse betyde celler ikke har haft tid til at oprette forbindelse og/eller ældre, og for langt, kan resultere i celler overbelægning, vanskeliggør billeddannelse. Selv om variabilitet mellem eksperimenter kan eksistere, stemmer resultater overens med rapporteret i oprindelige 2D cerebellare protokoller1,2. ICC farvning og gen expression analyse bekræfte tilstedeværelsen af celler positive for granula celle markør ZIC1, mens også identificere datamærker forbundet med andre neurale og cerebellare identiteter (figur 7 og figur 8). Calcium billeddannelse, som omfatter elektrisk stimulation af cellerne inkuberes med fluor5 farvestof, anført funktionel neuronal aktivitet (figur 9, supplerende figur 1og supplerende figur 2), men det ikke er bekræftet hvis disse var granula celler. Det kan diskuteres, at ved at give celler mere tid til at modnes ved at forlænge varigheden af kultur sidste 35 dage, mængden af funktionelle neuronal aktivitet bør øge. Dette potentiale kunne udforskes nærmere i fremtiden.

Ud over linjer af forskning ovenfor foreslåede, ville det være af interesse at bestemme forskellene i produkt identiteter (mængde og kvalitet) mellem 2D- og 3D-protokoller. Betydningen af ydre FGFs var ikke testet i 2D-protokollen, og det ville være nyttigt at vide, hvis manglende 3D struktur efter plating, og så den tilknyttede signaling veje, ville gøre 2D kulturer mere eller mindre afhængig af dem tidligt mønster forbindelser. Mere skrabet protokoller (f.eks.ingen RA, BDNF, SAG) er lige så plausible linjer til yderligere undersøgelse. Endelig, fremtidige undersøgelser kunne drage fordel af nye forskningsværktøjer til bedre karakterisere (og vurdere generation effektivitet) human-specifikke cerebellare neuronal undertyper.

Med de givne forbehold in mente rapporterede begge protokoller kan anvendes til cerebellare differentieringer, med produkterne passer til forskellige formål. De kan tjene som praktisk udgangspunkter for forskere foretage pilotundersøgelser, test levedygtighed af cellelinjer til sådanne differentieringer, eller som en grundlæggende model for andre typer af målrettede neurale differentiering.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Gerbren Jacobs og Jurjen Broeke deres teknisk ekspertbistand til Prisca Leferink for at bidrage til generation og karakterisering af to kontrol iPSC linjer og Lisa Gasparotto for at vise vores procedurer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12+Glutamax Gibco 31331-028 glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium Gibco 21103-049 neural basic medium
N2 supplement Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504001
Insulin Imgen PT468-B
L-glutamine Gibco 25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma P3932 aka Poly-Hema
Laminin Sigma L2020
E8 medium and supplement Gibco A1517001 hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Sodium Chloride Sigma S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor) SelleckChem S1049-10mg
DMSO Sigma D-2650
Geltrex Gibco A1413302 hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA Gibco 15575-020
0.2 um filter VWR 28145-77
1.5 mL Eppendorf tube VWR 525-0130
DMEM/F12 Gibco 21331-020
Ethanol VWR 83804360
Parafilm Sigma PM996 wrap for culture plates
cryotubes ThermoFisher 368632
TrypLE Gibco 12563-029 trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R-007-100
FGF-2 Peprotech 100-18B
FGF-4 R&D Systems 100-31
FGF-8B Peprotech 100-25
Retinoic Acid Sigma R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10
Potassium Chloride Sigma P5405
Neurotrophic Factor 3 Peprotech 450-03
Smoothened Agonist (SAG) Cayman 11914 CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope Zeiss Brightfield imaging microscope
Axiocam Zeiss Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810 Eppendorf 521-0996 centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing) Braun Medical 3623140
5 ml Serological pipets VWR 612-4950
10 ml Serological pipets VWR 612-4951
6-wells culture plates VWR 734-2323
12-wells culture plates VWR 734-2324
hESCs WiCELL line H01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
  2. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).
  3. Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
  4. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
  5. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
  6. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
  7. Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).
  8. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
  9. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
  10. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
  11. Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
  12. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
  13. Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  14. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
  16. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
  17. Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  18. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).

Tags

Udviklingsmæssige biologi emnet 130 3D organoid pluripotente stamceller lillehjernen granula celle cortex
Strømlinet 3D cerebellare differentiering protokol med valgfri 2D ændring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holmes, D. B., Heine, V. M.… More

Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification. J. Vis. Exp. (130), e56888, doi:10.3791/56888 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter