Cristalização de proteínas
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Overview
Cristalização proteica, obtenção de uma rede sólida de biomoléculas, elucida estrutura proteica e permite o estudo da função proteica. A cristalização envolve a secagem da proteína purificada sob uma combinação de muitos fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e concentração de proteínas. Uma vez obtidos cristais, a estrutura proteica pode ser elucidada por difração de raios-X e computação de um modelo de densidade eletrônica.
Este vídeo introduz cristalização de proteínas e mostra um procedimento geral. A expressão e purificação da proteína, a cristalização e a difração de raios-X são abordadas no procedimento. As aplicações da cristalização proteica incluem no projeto de medicamentos de silico, determinação do local de ligação e análise da estrutura da proteína da membrana.
Cristalização proteica é o processo de obtenção de uma forma sólida latticed de uma proteína. Esses cristais são especialmente valiosos para biólogos estruturais, auxiliando no estudo da função proteica. Outras técnicas, como a especificação de massa ou ODS-PAGE, só podem fornecer informações sobre a estrutura unidimensional das proteínas. A cristalização proteica é complementada pelas técnicas de expressão proteica recombinante e difração de raios-X. Este vídeo mostrará os princípios da cristalização proteica, um procedimento laboratorial geral e várias de suas aplicações no campo bioquímico.
O primeiro passo necessário no processo é obter quantidades miligramas de proteína muito pura, tipicamente usando expressão de proteína recombinante. O gene correspondente à proteína de interesse é clonado em um vetor de expressão, e a proteína expressa é fundida a uma etiqueta de afinidade, como a poli-histidina, para auxiliar na purificação por cromatografia de afinidade. Para saber mais, veja o vídeo desta coleção sobre cromatografia de afinidade.
A formação da proteína purificada em cristais depende da combinação adequada de muitos fatores, incluindo pH, força iônica, concentrações de precipitantes e proteínas, temperatura e taxa de equilíbrio. O método mais comum utilizado é a difusão de vapor, das quais existem duas categorias: queda pendurada e queda sentada. Uma gotícula contendo proteína pura, tampão e precipitante, que é um sólido iônico que liga moléculas de água, reduzindo a disponibilidade de água para a proteína e imitando maior concentração de proteínas, está em um microwell fechado com um reservatório com uma mistura mais altamente concentrada do mesmo tampão e precipitante. No início, as concentrações de proteína e precipitante são muito baixas para causar cristalização. Durante o experimento, a água vaporiza a partir da gotícula e coleta no reservatório; uma diminuição na quantidade de água na gotícula faz com que o sistema fique supersaturado, e a nucleação, seguida de cristalização, pode ocorrer. A transferência líquida de água da gotícula está em equilíbrio, e o sistema é mantido até que o processo seja concluído.
Para visualizar a estrutura 3D, é utilizada a difração de raios-X. Para obter dados de raio-x de um cristal, ele é colocado em um feixe de raio-x monocromático, onde é exposto ao feixe em todos os ângulos. Cada exposição fornece uma imagem, onde cada ponto é um raio-x difundido, que emerge do cristal e é registrado por um detector. Os dados são combinados para produzir um modelo do arranjo de átomos dentro do cristal. A estrutura cristalina resultante demonstra a colocação tridimensional dos átomos, com uma resolução típica de 2 angstroms.
Agora que cobrimos os princípios da cristalização de proteínas, vamos olhar para um protocolo generalizado.
Para iniciar o procedimento, um vetor de expressão contendo o gene de interesse é transformado em células. As células são incubadas e na fase de registro médio, a expressão é iniciada adicionando um indutor, como o IPTG, que desencadeia a transcrição do mRNA do gene. Após a expressão proteica, o material bruto é suspenso em tampão de lise e, em seguida, esclarecido por centrifugação.
O lise esclarecido é então carregado em uma coluna de níquel, e a proteína marcada por polihistidina se liga à coluna enquanto todas as outras biomoléculas são lavadas.
Uma vez obtidos vários miligramas de proteína pura, ele está pronto para cristalização por difusão de vapor. Uma bandeja de gota suspensa/sentada de 24 poços é preenchida com concentrações variadas de soluções de cloreto de sódio e tampão de acetato de sódio. Para o método de queda sentada, volumes iguais de proteína e solução de reservatório são encatos na prateleira acima de cada poço, e então a bandeja é coberta com fita transparente. A bandeja é então colocada em uma câmara de incubação, e os poços são monitorados para crescimento no dia seguinte, então a cada poucos dias.
Uma vez obtido um cristal adequado, ele está pronto para análise de difração de raios-X. O cristal é montado em um goniômetro para posicionar o cristal em orientações selecionadas. O cristal é iluminado com um feixe monocromático de raios-X em todos os ângulos, produzindo um padrão de difração. O software converte as imagens bidimensionais, tiradas em diferentes orientações, em um modelo tridimensional da densidade de elétrons dentro do cristal, determinando as posições dos átomos no cristal.
Agora que revisamos um procedimento, vamos rever algumas aplicações úteis de cristalização de proteínas, e outra técnica de cristalização.
A cristalização proteica pode ser usada no projeto de medicamentos de sílico. A estrutura tridimensional da proteína básica de polimerase 2 do vírus influenza, que tem sido ligada à infecção viral em mamíferos, foi determinada pela cristalização e difração de raios-X. Potenciais locais de ligação na proteína são visualizados, e com o uso de um programa de acoplamento, uma molécula tridimensional foi projetada que se inseriria em uma fissura na proteína.
A co-cristalização de complexos de proteína-DNA também é uma técnica útil. Proteínas de ligação de DNA modulam uma grande variedade de funções biológicas, como transcrição e polimerização de DNA e reparação de DNA; e estruturas cristalinas desses complexos podem fornecer informações sobre a função proteica, o mecanismo e a natureza da interação específica. A proteína E. coli SeqA, um regulador negativo da replicação do DNA, foi co-cristalizada com DNA hemimimetilado.
Proteínas integrais de membrana, como receptores acoplados de proteína G, ou GCPRs, são difíceis de cristalizar devido à sua quantidade limitada de área de superfície polar disponível para a formação de contatos de rede cristalina, o que levou ao desenvolvimento da cristalização de proteína assistida por proteína de fusão. Genes codificando receptor β2 adrenérgico, um GCPR e uma lisozyme foram inseridos em um vetor de expressão. A cristalização da proteína de fusão β2AR-lysozyme foi alcançada devido ao aumento da superfície hidrofílica extracelular sobre o β2AR naturalmente hidrofóbico, fornecido pela lise, necessário para formar interações de embalagem na rede cristalina.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre cristalização de proteínas. Este vídeo descreveu seus princípios, um protocolo generalizado, e alguns de seus usos no campo biomédico. Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Protein crystallization is the process of obtaining a latticed solid form of a protein. These crystals are especially valuable to structural biologists, assisting in the study of protein function. Other techniques, such as mass spec or SDS-PAGE, can only provide information on the one-dimensional structure of proteins. Protein crystallization is complemented by the techniques of recombinant protein expression and x-ray diffraction. This video will show the principles of protein crystallization, a general laboratory procedure, and several of its applications in the biochemical field.
The first step required in the process is to obtain milligram quantities of very pure protein, typically using recombinant protein expression. The gene corresponding to the protein of interest is cloned into an expression vector, and the expressed protein is fused to an affinity tag, such as poly-histidine, to assist in the purification by affinity chromatography. To learn more, see this collection’s video on affinity chromatography.
Formation of the purified protein into crystals is dependent on the proper combination of many factors, including pH, ionic strength, concentrations of precipitant and protein, temperature, and rate of equilibration. The most common method used is vapor diffusion, of which there are two categories: hanging drop and sitting drop. A droplet containing pure protein, buffer, and precipitant, which is an ionic solid that binds water molecules, reducing water availability for the protein and mimicking higher protein concentration, is in an enclosed microwell with a reservoir with a more highly concentrated mixture of the same buffer and precipitant. At the beginning, the concentrations of protein and precipitant are too low to cause crystallization. During the course of the experiment, water vaporizes from the droplet and collects in the reservoir; a decrease in the amount of water in the droplet causes the system to become supersaturated, and nucleation, followed by crystallization, can occur. The net transfer of water from the droplet is in equilibrium, and the system is maintained until the process is complete.
To visualize the 3D structure, x-ray diffraction is used. To obtain x-ray data from a crystal, it is placed in a monochromatic x-ray beam, where it is exposed to the beam at all angles. Each exposure provides an image, where each spot is a diffracted x-ray, which emerges from the crystal and is registered by a detector. The data are combined to produce a model of the arrangement of atoms within the crystal. The resulting crystal structure demonstrates the 3-dimensional placement of the atoms, with a typical resolution of 2 angstroms.
Now that we have covered the principles of protein crystallization, let us look at a generalized protocol.
To begin the procedure an expression vector containing the gene of interest is transformed into cells. The cells are incubated and at mid-log phase, expression is initiated by adding an inducer, such as IPTG, which triggers transcription of the gene’s mRNA. After protein expression, the crude material is suspended in lysis buffer, and then clarified by centrifugation.
The clarified lysate is then loaded onto a nickel column, and the polyhistidine-tagged protein binds to the column while all other biomolecules are washed away.
Once several milligrams of pure protein have been obtained, it is ready for crystallization by vapor diffusion. A 24-well hanging/sitting drop tray is filled with varying concentrations of sodium chloride and sodium acetate buffer solutions. For the sitting drop method, equal volumes of protein and reservoir solution are pipetted onto the shelf above each well, and then the tray is covered with transparent tape. The tray is then placed in an incubation chamber, and the wells are monitored for growth the following day, then every few days.
Once a proper crystal has been obtained it is ready for x-ray diffraction analysis. The crystal is mounted on a goniometer to position the crystal at selected orientations. The crystal is illuminated with a monochromatic beam of x-rays at all angles, producing a diffraction pattern. The software converts the two-dimensional images, taken at different orientations, to a three-dimensional model of the density of electrons within the crystal by determining the positions of the atoms in the crystal.
Now that we have reviewed a procedure, let’s review some useful applications of protein crystallization, and another crystallization technique.
Protein crystallization may be used for in silico drug design. The three-dimensional structure of Influenza virus’s polymerase basic protein 2, which has been linked to viral infection in mammals, was determined by crystallization and x-ray diffraction. Potential binding sites in the protein are visualized, and with the use of a docking program, a three-dimensional molecule was designed that would insert into a cleft in the protein.
Co-crystallization of protein-DNA complexes is also a useful technique. DNA-binding proteins modulate a wide variety of biological functions such as transcription and DNA polymerization and DNA repair; and crystal structures of these complexes can provide insight into protein function, mechanism, and the nature of the specific interaction. The E. coli protein SeqA, a negative regulator of DNA replication, was co-crystallized with hemimethylated DNA.
Integral membrane proteins such as G-protein coupled receptors, or GCPRs, are difficult to crystallize due to their limited amount of polar surface area available for forming crystal lattice contacts, which has led to the development of fusion-protein-assisted protein crystallization. Genes encoding β2 adrenergic receptor, a GCPR, and a lysozyme were inserted into an expression vector. The crystallization of the β2AR- lysozyme fusion protein was achieved due to the increased extracellular hydrophilic surface over the naturally hydrophobic β2AR, provided by the lysozyme, necessary for forming packing interactions in the crystal lattice.
You’ve just watched JoVE’s video on protein crystallization. This video described its principles, a generalized protocol, and some its uses in the biomedical field. Thanks for watching!
