Kvantifisering av endogene Auxin og Cytokinin under Internode kultur Ipecac
Summary
Adventivskudd skudd kan bli indusert på internodal segmenter Ipecac uten phytohormone behandling. For å evaluere phytohormone dynamics under adventivskudd skyte formasjon, målte vi endogene auxin og cytokinin i internodal segmenter av LC–MS-/ MS.
Abstract
Adventivskudd skyte formasjon er en viktig teknikk for overføring av økonomisk viktigste avlinger og fornyelse av transgene planter. Phytohormone behandling kreves for induksjon av adventivskudd skudd i de fleste arter. Om adventivskudd skudd kan indusert bestemmes av balansen mellom auxin og cytokinin (CK) nivåer. Mye arbeid går inn å bestemme optimal konsentrasjon og kombinasjoner av phyto-hormoner i hvert vev som explants og i hver plantearter. I ipecac, kan det være indusert imidlertid adventivskudd skudd på internodal segmenter i kultur medium uten phytohormone behandling. Dette gjør at iboende plastisitet Ipecac for celledifferensiering evalueres. For å indusere adventivskudd skudd i ipecac, kultivert vi internodal segmenter på 24 ° C 15 µmol m2 s−1 lys i en 14-h lys/10-h mørke syklus på phytohormone-fri B5 medium befestet med 0,2% gellan tyggegummi i 5 uker. For å undersøke phytohormone dynamics under adventivskudd skyte formasjon, målte vi endogene indol-3-eddiksyre og CKs i segmenter av flytende kromatografi-tandem massespektrometri LC–MS-/ MS. Denne metoden tillater analyse av endogene indol-3-eddiksyre og CKs nivåer på en enkel måte. Den kan brukes for å undersøke dynamikken i endogene auxin og CK under organogenesen i andre plantearter.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) foreslo konseptet “totipotency”, av hvilke anlegg celler kan dele skille og regenerere hele planter selv etter deres tidligere differensiering inn spesifikke celletyper i eldre planter1. I vev kultur bestemmes om anlegget gjenfødelse kan bli indusert eller ikke av kombinasjonen og konsentrasjonen av exogenously anvendt phyto-hormoner i vekst medium. Skoog og Miller fant at adventivskudd skudd kan bli indusert fra tobakk callus på kultur medium som inneholder en høy andel av CKs til auxins, mens adventivskudd røtter kan bli indusert på medium som inneholder en lav ratio2. Siden at å finne, har vev kultur vært mye brukt for overføring av økonomisk viktigste avlinger og fornyelse av transgene planter3. Adventivskudd skudd kan bli indusert fra vev enn skyte apikal meristem, som blader, røtter og internodes. Phytohormone behandling kreves for induksjon av adventivskudd skudd i de fleste plantearter. Men varierer optimal konsentrasjon og kombinasjoner av arter og vev brukes som explants. Dermed går mye arbeid inn å bestemme optimal konsentrasjon og kombinasjoner av phyto-hormoner for eksperimenter.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) er en medisinsk plante som inneholder alkaloider som emetine og cephaeline, hovedsakelig i røtter4. Rot ekstrakt brukes som en slimløsende, et brekkmiddel og en amoebicide5. Ipecac vokser naturlig i de tropiske regnskogene i Brasil, det er motvillig til å angi frø i kultur og spiring prisen synker under seed lagring i Japan, med sin kaldere klima6. I stedet det er overført av vev kultur, som adventivskudd skyte formasjon på internodes er den mest effektive metoden7,8. Interessant, kan adventivskudd skudd bli indusert i denne arten uten phytohormone behandling8.
Adventivskudd skudd er dannet på epidermis i regionen apikale internodal segmenter uten callusing, men ikke i den basale region9. Denne forskjellen angir vev polaritet i internodal segmenter, som sannsynligvis er under phytohormonal forskriften. Ipecac kultur systemet tillater en unik mulighet til å analysere endringer i endogene phytohormone nivåer under adventivskudd skyte formasjon. Her introduserer vi vår metode for analyse av endogene en auxin (indol-3-eddiksyre (IAA)) og fire CKs (isopentenyl adenine (iP), isopentenyl adenine riboside (iPR), trans-zeatin (tZ) og trans-zeatin riboside (tZR)) i internodal segmenter ved hjelp av LC–MS-/ MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å identifisere fordelingen av phyto-hormoner involvert i organogenesen, er det viktig å bruke plantemateriale som organogenesen kan sees på phytohormone-fri medium, fordi når phyto-hormoner, exogenously brukes på explants for induksjon skyter eller røtter, de påvirker det hele explant, noe som gjør det vanskelig å vurdere den iboende plastisitet av celledifferensiering og organogenesen. Adventivskudd skudd kan bli indusert på phytohormone-fri kultur medier i andre plantearter som Dianthus caryophyllus</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Mr. Akira Murakami av Institutt for anvendt biovitenskap, Toyo University og Mr. Koudai Taniguchi av Gunma Agricultural teknologisenteret for deres kundestøtte. Vi er også takknemlige for Professor Shosaku Kashiwada og Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo universitet for sine forslag. Denne studien var støttes delvis av den Research Center for livet og miljøfag, Toyo University.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
