Reprogramación neuronal directa genera neuronas que mantienen la edad de la partida de la célula somática. Aquí, describimos un método único basado en vectores para generar neuronas inducidas de fibroblastos dérmicos obtenidos de donantes humanos adultos.
Inducida por las neuronas (iNs), el producto de las células somáticas convertido directamente a las neuronas, son una forma de obtener neuronas paciente derivados de tejido que es fácilmente accesible. Por esta vía, las neuronas maduras se pueden obtener en cuestión de unas semanas. Aquí, describimos un protocolo sencillo y rápido de un solo paso para obtener iNs de fibroblastos dérmicos obtenidos mediante biopsias de adultos donantes humanos. Explicamos cada paso del proceso, incluyendo el mantenimiento de los fibroblastos dérmicos, el procedimiento de congelación para la construcción de un stock de la línea celular, siembra de las células para la reprogramación, así como las condiciones de cultivo durante el proceso de conversión. Además, se describe la preparación de vidrio cubreobjetos para grabaciones electrofisiológicas y condiciones a largo plazo de la capa celular de fluorescencia activada (FACS) de clasificación. También ilustran ejemplos de los resultados a esperar. El protocolo descrito aquí es fácil de realizar y pueden ser aplicadas al ser humano los fibroblastos derivados procedentes de biopsias de piel humana de pacientes con diversos diagnósticos diferentes y edades. Este protocolo genera una cantidad suficiente de iNs que se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones biomédicas, incluyendo enfermedad modelado, detección de drogas y validación del objetivo.
Desarrollo de tratamientos eficaces para los trastornos neurológicos se han visto obstaculizados por el acceso limitado a las células del cerebro humano vivas para realizar estudios mecanísticos y análisis funcionales. Sobre hace una década, esta situación cambió radicalmente con el desarrollo de pluripotentes inducidas (iPSCs) de la célula de vástago tecnología1,2. Esto, combinado con una mejor comprensión de los mecanismos de diferenciación de los nervios que ocurre durante el desarrollo normal humano, ha permitido la generación de definido y diversos subtipos neuronales de material específico de paciente y enfermedad. Con ese material, ahora es posible estudiar mecanismos intracelulares subyacente a enfermedades neurológicas y el potencial de los diferentes compuestos para aliviar esas características patológicas3.
Aunque iPSCs han sido revolucionarios en el campo de la neurociencia, uno de los principales inconvenientes de estas células es que su firma de envejecimiento se borra durante el proceso de reprogramación de tal manera que la neurona rejuvenecida no conserva la vulnerabilidad asociada a envejecimiento de4,5,6. Esta característica particular de las neuronas que se producen puede terminar siendo crítico para recapitular muchos aspectos de la cascada patógeno intracelular, particularmente en el caso de que la vejez es un factor de riesgo importante de enfermedades.
Directo reprogramación neural es una tecnología donde una célula somática se convierte directamente en un de sin pasar por un pluripotentes paso intermedio. Esto permite la rápida generación de las neuronas humanas en vitro que puede ser paciente y enfermedad específica. Una característica notable de reprogramación directa es que la edad a partir de la célula donante se mantiene, y con eso, su vulnerabilidad a los procesos del envejecimiento tales como aumento de la producción de estrés oxidativo4,7. Como resultado, iNs de pacientes con enfermedades neurológicas asociadas con el envejecimiento, tales como la enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, son ideales para una amplia gama de aplicaciones biomédicas, incluyendo la enfermedad de modelado, análisis y estudios de Toxicología de la detección de drogas .
La salvedad principal que ha impedido iNs pacientes con enfermedades neurodegenerativas ser ampliamente utilizados es que no son fáciles de programar, y esto se vuelve aún más difícil con la expansión de los fibroblastos. Como resultado, generación de células en cantidades necesarias para este tipo de aplicaciones no ha conseguido hasta hace poco8. Ahora hemos desarrollado un método sencillo para reprogramar fibroblastos de donantes de cualquier edad de una manera muy eficiente. Este método combina la expresión forzada de los factores de transcripción neuronal Ascl1 y Brn2 con una caída del represor proteína RE1-silenciamiento del factor de transcripción (resto) usando un vector único. Aquí, describimos los diferentes pasos que conducen a la generación de iNs convertidos a partir de una biopsia de donantes mayores de fibroblastos de la piel.
Este vector de one-step/una reprogramación método proporciona una manera eficiente de obtener iNs de fibroblastos humanos adultos. Fibroblastos humanos adultos son normalmente más difíciles encubierta que fibroblastos fetales, con pocos estudios previamente informes de eficiencia de aproximadamente 5-10%12,13. Sin embargo, con este nuevo protocolo es posible alcanzar un rendimiento neuronal (medido como MAP2 + células) de aproximadamente 50%8. Además, nuestro protocolo puede utilizarse en fibroblastos dérmicos que han sido pasados varias veces sin perder eficiencia de conversión. Hasta ahora hemos utilizado células pasadas hasta 14 veces sin detectar cualquier disminución en la eficiencia de conversión. Además, no hay diferencias en eficacia en nuestras manos con fibroblastos de donantes de edad entre 52 y 87 de reprogramación. Para más detalles sobre la edad y la enfermedad de otras líneas celulares con esta construcción véase referencia8. Otros estudios también no han reportado ninguna diferencia en la eficiencia de conversión con un protocolo mejorado de molécula basada en lentivirales y pequeño donantes entre 0 y 89 años4. Además, aplicabilidad coherente con reprogramación neuronal basada en miRNA se ha divulgado en los fibroblastos de todas las edades, con los donantes entre 0 y7de 86 años. Por esta vía, las neuronas maduras se pueden obtener en aproximadamente 12-15 semanas en vitro o aproximadamente 8 semanas después del trasplante en vivo8. Esto es una ventaja porque da acceso a la enfermedad y paciente iNs humano específico del tejido que sea fácilmente accesible. Aunque este protocolo es eficiente, no va a producir un 100% de rendimiento neuronal, y como tal se requiere un paso de purificación usando FACS por ejemplo.
El paso más crítico dentro de este protocolo es la transducción viral (Protocolo de la sección 4). Es crucial que el título del virus es preciso, además tener plateado un número exacto de aHDFs para la conversión. La concentración recomendada para su uso con este protocolo es de 4 x 108 a 4 x 109. Utilizando un título de cualquier cosa por debajo de 1 x 108 no se recomienda como agregar grandes cantidades de virus será tóxicos para las células. Por otra parte, como los fibroblastos comienzan a encubierta a iNs será más frágil y susceptible a la elevación. Es esencial para ser suave al cambiar los medios de comunicación que no para molestar demasiado a las células. Esto puede hacerse quitando el líquido lentamente con una pipeta μL 1.000. Finalmente, cuando el recubrimiento para la reprogramación (Protocolo, artículo 3) es importante garantizar una población sana del fibroblasto antes de comenzar un experimento; Esto es indicado por una viabilidad celular de sobre el 90% con tinción de azul de tripano. El aHDFs siempre debe ser pasados antes de llegar a la confluencia del 95%.
Si hay muerte de la célula sensible antes de transducción viral, no comience la conversión: comprobar que la viabilidad de las células es superior al 90% y que no había ningún problema con la capa de la placa. Se espera que una pequeña cantidad de la muerte celular después de transducción viral, sin embargo, esto no debería ser significativo. En este caso, confirmar la correcta siembra de 50.000 aHDFs/pozo y Compruebe la concentración de virus. Si hay incoherencia notoria entre pozos durante la conversión, primero Verifique que cada pozo contiene la misma cantidad de medios de comunicación y evaporación abierta no ocurre en los bordes (si necesarios medios adicionales pueden añadirse a los pozos de borde). Alternativamente, verifique paso 4.4 y asegurar una mezcla apropiada para una suspensión homogénea cuando transductoras. Es fundamental agregar el lentivirus al medio en primer lugar, antes de Agregar esto en los pocillos. Directamente añadir lentivirus en los pozos aumentará la variabilidad de pozo a pozo y también es probable que sea tóxico para las células. Por último, compruebe siempre que el medio es calentado a 37 ° C antes de agregar a las células.
Este protocolo incluye secciones opcionales para condiciones de capa para largo plazo cultivo de iNs y FACS clasificación para aumentar la pureza neuronal. Para los experimentos para investigar la caracterización funcional de iNs, un protocolo para la preparación de vidrio cubreobjetos para electrofisiología también se ha incluido. El protocolo de conversión aquí está configurado para utilizar con una placa de 24 pozos; Si lo desea este puede ser modificado a un 6, 12, 48, placa de 96 pocillos o frascos. En este caso, favor de ajustar todos los volúmenes a la superficie de la placa o frasco utilizado.
Este protocolo utiliza la expresión forzada de Ascl1 y Brn2 en combinación con una caída de resto todo empaquetado en un solo vector8 generar iNs de un fenotipo neuronal de pan. La generación de cualquier subtipos gliales con este método, sin embargo, no ha sido evaluado. Este método así tendría que ser modificado para su uso con otros factores de reprogramación para obtener a subtipo neuronas específicas. La reprogramación directa ha demostrado previamente la posibilidad de generar las neuronas motoras, neuronas sensoriales, fotorreceptores, neuronas espinosas medianas estriada y de10,de las neuronas dopaminérgicas14. Esto será beneficioso al investigar enfermedades neurológicas en qué subtipo neuronal específica son afectados preferentemente, para ejemplo de Parkinson y las neuronas dopaminérgicas.
Hasta hace poco, tecnología reprogramación neural directa no permitían la producción de iNs de manera estandarizada y eficiente, a un nivel que se requiere para toxicología y análisis a gran escala de detección de drogas. Este nuevo método es muy eficiente y puede ser utilizado en los fibroblastos que han pasados muchas veces, que ahora elimina estas restricciones y se abre para una amplia gama de estudios, no sólo en un sistema neuronal humano, sino también en un sistema que puede ser paciente específico. La sencillez de este enfoque hace que la tecnología en accesible para cualquier grupo que deseen realizar estudios similares en y se puede utilizar fácilmente para aplicaciones biomédicas a gran escala, como la detección de drogas y los análisis de toxicología, pero también para apoyar datos derivados de modelos animales y humanos post mortem muestras de tejido.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Marie Persson Vejgården para asistencia técnica. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de la Fundación de células madre de Nueva York, el Consejo Europeo de investigación bajo el séptimo programa marco de la Unión Europea: FP/2007-2013 Neuro células madre reparación (Nº 602278) y el acuerdo de subvención del CEI no. 30971, el Consejo Sueco de investigación (conceder acuerdo 521-2012-5624, 2016-00873 y 70862601 / Bagadilico), Fundación de Parkinson sueca (Parkinsonfonden) y el área estratégica de investigación en Lund Universidad Multipark (investigación multidisciplinaria en Enfermedad de Parkinson). Janelle Drouin-Ouellet es apoyado por una beca de los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR) (#358492), y Roger Barker es apoyado por una subvención del centro de investigación biomédica NIHR a la Universidad de Cambridge/Hospital Addenbrooke. Malin Parmar es un investigador de Nueva York células madre Fundación Robertson. Shelby Shrigley es financiado por la Unión Europea horizonte 2020 programa (H2020-MSCA-ITN-2015) bajo la red de formación innovadora de Marie Skłodowska-Curie y Grant acuerdo no. 676408.
Cell Lines | |||
Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old male. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
Milli-Q Water | Millipore | ||
Basal medium – Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
Neural differentiation medium – NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
Reagents for Coatings | |||
Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
Cell dissociation agent – Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, – phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
Reagents for Glass Coverslips | |||
Autoclaved deionized water | |||
Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
Ethanol 95% | |||
Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
Reagents for Immunocytochemistry | |||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
Equipment | |||
T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 – 1,000 µL. | ||
Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
Parafilm M | VWR | ||
ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
Laminar flow hood | |||
Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
Orbital shaker | |||
Sonicator – Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |