Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact
Summary
Obtention de l’ADN génomique de haute qualité provenant de tissus de la tumeur est une première étape essentielle pour l’analyse des altérations génétiques à l’aide de séquençage de la génération suivant. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et rapide pour enrichir les cellules tumorales et obtenir des ADN intact de toucher les échantillons de cytologie mentions légales.
Abstract
Il est essentiel de déterminer le statut mutationnel dans le cancer avant administration et traitement des médicaments ciblés moléculaires spécifiques pour les patients atteints de cancer. Dans le contexte clinique, fixés au formol les tissus inclus en paraffine (FFIP) sont largement utilisés pour les tests génétiques. Cependant, FFPE ADN est généralement endommagé et fragmentée au cours du processus de la fixation par le formol. Par conséquent, FFPE ADN n’est parfois pas suffisant pour les tests génétiques en raison de la faible qualité et la quantité d’ADN. Nous présentons ici une méthode de cytologie d’empreinte tactile (TIC) pour obtenir l’ADN génomique des cellules cancéreuses, qui peut être observé au microscope. Nombre de cellules du cancer et de la morphologie cellulaire peut être évalué à l’aide de spécimens TIC. En outre, l’extraction de l’ADN génomique provenant d’échantillons TIC peut être complétée dans les deux jours. Le montant total et la qualité des TIC ADN obtenu à l’aide de cette méthode était supérieur à celui de la FFPE ADN. Cette méthode simple et rapide permet aux chercheurs d’obtenir des ADN de haute qualité pour les tests génétiques (par exemple, analyse de la génération prochaine séquence, numérique de PCR et PCR quantitative en temps réel) et de raccourcir le délai pour la présentation des résultats.
Introduction
Prochaine génération technologie de séquençage a fourni des chercheurs des progrès importants dans l’analyse de l’information de génome de variations génétiques, maladies mendéliennes, prédispositions héréditaires et cancer 1,2,3 . Le Cancer Genome Atlas (TCGA) et l’International Cancer Genome Consortium (oncologie) ont poursuivi l’identification des altérations génétiques dans plusieurs types de cancers communs4. Des centaines de gènes de pilote au cancer essentielles ont été identifiées avec succès, et certaines de ces molécules sont ciblés pour drug development1,5,6.
Dans le contexte clinique, échantillons FFPE sont couramment utilisés pour le diagnostic pathologique et tests moléculaires pour diverses maladies, y compris le cancer. Toutefois, au cours du processus de la fixation par le formol, la réticulation ADN-protéines ou d’ADN intervient et fragmentation de l’ADN est induite. Ainsi, les échantillons FFPE ADN ne conviennent pas toujours pour l’analyse génétique en raison de la faible qualité et la quantité d’ADN7,8,9. En outre, il faut plusieurs jours pour préparer des échantillons FFPE et habileté technique n’est nécessaire d’établir avec précision les sections. Par conséquent, il est souhaitable d’élaborer une méthode simple et rapide pour obtenir qualité ADN intact.
Cytologie est une méthode alternative pour le diagnostic pathologique. Préparation des échantillons cytologiques est plus simple, moins coûteux et plus rapide approche contre FFIP préparation10. La technique TIC a été réalisée sur les ganglions sentinelles et marginales tissus de patients atteints de cancer du sein pour un diagnostic rapide peropératoire pour quelques années11,12. Cependant, il y a peu de rapports qui ont tenté de déterminer si l’ADN génomique de haute qualité peut être extraites de spécimens TIC et utilisé pour l’analyse génétique ultérieure. Les échantillons cytologiques sont couramment tachées de Papanicolaou (Pap) ou la coloration de Giemsa, et nous avons déjà indiqué que la quantité et la qualité de l’ADN extrait d’échantillons TIC (en particulier les échantillons colorés au Giemsa) sont supérieurs aux échantillons prélevés FFIP 13de tissus. Par rapport à la coloration de Pap, coloration de Giemsa a un avantage d’exiger moins méthodes de coloration. Dans la coloration de Pap, après que les échantillons ont été fixés et colorés, ils doivent être montés avec montage moyen (par exemple, Malinol) pour distinguer le contenu de l’échantillon, telles que les cellules tumorales, les cellules normales et des cellules inflammatoires au microscope. Si le spécimen de Pap est préparé sans l’étape de montage, il est presque impossible d’observer des cellules au microscope parce que l’échantillon est séché. En comparaison, la coloration au Giemsa peut être observée à l’état séché, l’étape de montage n’est donc pas nécessaire pour une évaluation rapide cellulaire. Pour microdissection, coloration de Giemsa est plus appropriée car il nécessite des spécimens secs.
Dans ce rapport, nous présenter une méthode simple et rapide pour la préparation de spécimens TIC avec coloration de Giemsa et démontrer que les TIC est une meilleure source d’ADN par rapport aux échantillons FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons présenté une méthode alternative pour l’obtention de tumeur ADN des échantillons pathologiques cliniques utilisant les TIC. Préparation des TIC est très simple et nécessite moins de temps par rapport aux méthodes FFIP, sans la nécessité d’instruments spéciaux10. Toutes les procédures de la préparation de TIC à l’extraction de l’ADN peuvent être complétées dans les deux jours (Figure 1). Cette méthode raccourcit a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tout le personnel médical et auxiliaire de l’hôpital et les patients pour consentir à participer. Nous remercions Gabrielle White Wolf, Ph.d., du groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour éditer une ébauche du présent rapport. Cette étude a été financée par une subvention de Genome Research Project de la préfecture de Yamanashi (Y.H. et M.O.) et une subvention de la YASUDA Medical Foundation (Y.H.).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
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