Interactome-Seq: फेज प्रदर्शन और अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा Domainome पुस्तकालय निर्माण, सत्यापन और चयन के लिए एक प्रोटोकॉल
Summary
प्रोटोकॉल का वर्णन निर्माण, लक्षण वर्णन और चयन की अनुमति (पसंद के लक्ष्य के खिलाफ) एक “domainome” किसी भी डीएनए स्रोत से बना पुस्तकालय । फेज प्रदर्शन, एक तह रिपोर्टर और डेटा विश्लेषण के लिए एक वेब उपकरण के साथ अगली पीढ़ी sequencing: यह एक अनुसंधान पाइपलाइन है कि विभिन्न प्रौद्योगिकियों को जोड़ती द्वारा हासिल की है.
Abstract
तह रिपोर्टर ऐसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध, जिसकी तह और समारोह के रूप में आसानी से पहचाने phenotypes, के साथ प्रोटीन है जब खराब तह प्रोटीन या यादृच्छिक खुले पढ़ने के फ्रेम से जुड़े समझौता किया है । हम एक रणनीति विकसित की है, जहां, उनि का उपयोग करके-1 β-lactamase (एम्पीसिलीन प्रतिरोध एंजाइम) एक जीनोमिक पैमाने पर, हम सही ढंग से जोड़कर प्रोटीन डोमेन के संग्रह का चयन कर सकते हैं किसी भी intronless जीनोम के डीएनए के कोडिंग भाग से. इस दृष्टिकोण के द्वारा प्राप्त प्रोटीन टुकड़े, तथाकथित “domainome”, अच्छी तरह से व्यक्त किया जाएगा और घुलनशील, उन्हें संरचनात्मक/कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाने.
क्लोनिंग और प्रदर्शित करके “domainome” सीधे एक फेज प्रदर्शन प्रणाली में, हमने दिखाया है कि यह वांछित बाध्यकारी गुणों के साथ विशिष्ट प्रोटीन डोमेन का चयन करने के लिए संभव है (जैसे, अंय प्रोटीन या एंटीबॉडी के लिए), इस प्रकार आवश्यक प्रदान जीन एनोटेशन या प्रतिजन पहचान के लिए प्रयोगात्मक जानकारी।
एक चयनित polyclonal जनसंख्या में सबसे समृद्ध क्लोन की पहचान उपंयास अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों (NGS) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, हम ही पुस्तकालय और चयन outputs के गहरे अनुक्रमण विश्लेषण परिचय विविधता, बहुतायत और चयनित टुकड़ा में से प्रत्येक की सटीक मानचित्रण पर पूरी जानकारी प्रदान करने के लिए । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पुस्तकालय निर्माण, लक्षण वर्णन, और सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण कदम दिखा ।
Introduction
यहां, हम निर्माण और किसी भी genic/जीनोमिक प्रारंभिक स्रोत से जोड़ और घुलनशील प्रोटीन डोमेन के पुस्तकालयों के चयन के लिए एक उच्च प्रवाह विधि का वर्णन । फेज प्रदर्शन, डेटा विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट वेब उपकरण के साथ एक तह रिपोर्टर और अगली पीढ़ी sequencing (NGS) का उपयोग: दृष्टिकोण तीन विभिन्न प्रौद्योगिकियों को जोड़ती है. तरीकों की पहचान और नए प्रोटीन/प्रोटीन डोमेन, ज्ञात प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों के लक्षण वर्णन के रूप में अच्छी तरह से परिभाषा के लिए प्रोटीन आधारित अनुसंधान के कई अलग संदर्भों में इस्तेमाल किया जा सकता प्रोटीन-इंटरेक्शन नेटवर्क ।
कई खुले सवाल अभी भी प्रोटीन आधारित अनुसंधान में मौजूद है और इष्टतम प्रोटीन उत्पादन के लिए तरीकों के विकास की जांच के कई क्षेत्रों के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । उदाहरण के लिए, prokaryotic और eukaryotic जीनोम के हजारों की उपलब्धता के बावजूद1, कोडित प्रोटीन और पेप्टाइड्स का एक सीधा एनोटेशन के साथ रिश्तेदार proteomes के एक इसी नक्शे जीवों के महान बहुमत के लिए अभी भी याद आ रही है । पूरा proteomes की सूची एक चुनौतीपूर्ण समय और संसाधनों के संदर्भ में एक विशाल प्रयास की आवश्यकता के लक्ष्य के रूप में उभर रहा है । प्रयोगात्मक एनोटेशन के लिए स्वर्ण मानक सभी खुले पढ़ने के फ्रेम (ORFs) के एक जीनोम के क्लोनिंग, तथाकथित “ORFeome” के निर्माण रहता है । आमतौर पर जीन समारोह ज्ञात गतिविधि के संबंधित जीन के लिए समरूपता के आधार पर सौंपा है, लेकिन इस दृष्टिकोण खराब संदर्भ डेटाबेस में कई गलत एनोटेशन की उपस्थिति के कारण सटीक है2,3,4, 5. इसके अलावा, भी प्रोटीन है कि पहचान की गई है और व्याख्या के लिए, अतिरिक्त अध्ययन के लिए बहुतायत के संदर्भ में लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं, अलग संदर्भों में अभिव्यक्ति पैटर्न, संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण सहित के रूप में अच्छी तरह के रूप में संपर्क नेटवर्क ।
इसके अलावा, के बाद से प्रोटीन अलग डोमेन से बना रहे हैं, उनमें से प्रत्येक विशिष्ट सुविधाओं और अलग प्रोटीन कार्यों के लिए योगदान दिखा रहा है, अध्ययन और इन डोमेन की सटीक परिभाषा एक और अधिक व्यापक चित्र, दोनों में एक की अनुमति कर सकते है जीन और पूर्ण जीनोम के स्तर पर । यह सभी आवश्यक जानकारी प्रोटीन आधारित अनुसंधान एक व्यापक और चुनौतीपूर्ण क्षेत्र बनाता है ।
इस परिप्रेक्ष्य में, एक महत्वपूर्ण योगदान निष्पक्ष और प्रोटीन उत्पादन के लिए उच्च प्रवाह तरीकों द्वारा दिया जा सकता है । हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण की सफलता, काफी आवश्यक निवेश के बगल में, में घुलनशील उत्पादन की क्षमता पर निर्भर करता है/ यह एक प्रमुख सीमित कारक है क्योंकि यह अनुमान लगाया गया है कि केवल के बारे में 30% प्रोटीन सफलतापूर्वक व्यक्त किया जा सकता है और पर्याप्त स्तर पर उत्पादन के लिए उपयोगी6,7,8। एक दृष्टिकोण इस सीमा को दूर करने के लिए बेतरतीब ढंग से खंडित डीएनए के उपयोग के लिए अलग polypeptides, जो एक साथ व्यक्तिगत जीन का टुकड़ा प्रतिनिधित्व अतिव्यापी उपलब्ध कराने के उत्पादन पर आधारित है । केवल बेतरतीब ढंग से उत्पंन डीएनए अंशों का एक छोटा सा प्रतिशत कार्यात्मक ORFs है whilst उनमें से महान बहुमत गैर कार्यात्मक है (उनके दृश्यों के अंदर बंद करो codons की उपस्थिति के कारण) या संयुक्त राष्ट्र के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना-प्राकृतिक (एक फ्रेम में अंय मूल के अलावा ओआरएफ) कोई जैविक अर्थ के साथ polypeptides ।
इन सभी मुद्दों को हल करने के लिए, हमारे समूह एक उच्च प्रवाह प्रोटीन अभिव्यक्ति और संपर्क विश्लेषण मंच है कि एक जीनोमिक स्केल9,10,11,12पर इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित की है । यह मंच निम्नलिखित तकनीकों को एकीकृत करता है: 1) किसी भी जीव से डीएनए के कोडिंग भाग से सही ढंग से मुड़ा हुआ प्रोटीन डोमेन के संग्रह का चयन करने के लिए एक विधि; 2) फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी बातचीत के भागीदारों के चयन के लिए; 3) NGS पूरी तरह से अध्ययन के तहत पूरी interactome की विशेषता और ब्याज के क्लोन की पहचान; और 4) एक आसान और उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से Interactome-Seq विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए किसी भी bioinformatics या प्रोग्रामिंग कौशल के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए डेटा विश्लेषण के लिए एक वेब उपकरण.
इस मंच का उपयोग जांच की वैकल्पिक रणनीतियों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है; सभी विधि से ऊपर पूरी तरह से निष्पक्ष, उच्च प्रवाह है, और एक पूरे जीनोम के लिए एक भी जीन से लेकर अध्ययन के लिए मॉड्यूलर । पाइपलाइन का पहला कदम अध्ययन के तहत बेतरतीब खंडित डीएनए से एक पुस्तकालय के निर्माण, जो तब NGS द्वारा गहराई से विशेषता है । इस पुस्तकालय के एक इंजीनियर सदिश का उपयोग कर उत्पंन होता है जहां जीन/टुकड़े ब्याज के periplasmic अंतरिक्ष में प्रोटीन स्राव के लिए एक संकेत अनुक्रम के बीच क्लोन कर रहे है (यानी, एक एसईसी नेता) और TEM1 β-lactamase जीन । फ्यूजन प्रोटीन एम्पीसिलीन प्रतिरोध और एम्पीसिलीन दबाव के तहत जीवित रहने की क्षमता प्रदान करेगा केवल अगर क्लोन टुकड़े इन दोनों तत्वों और जिसके परिणामस्वरूप फ्यूजन प्रोटीन के साथ फ्रेम कर रहे हैं सही ढंग से जोड़ रहा है10,13 ,14. सभी क्लोनों एंटीबायोटिक चयन के बाद बचाया, तथाकथित “फ़िल्टर क्लोन”, ORFs और कर रहे हैं, उनमें से एक महान बहुमत (अधिक से अधिक ८०%), असली जीन9से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, इस रणनीति की शक्ति निष्कर्षों में निहित है कि सभी ओआरएफ फ़िल्टर किए गए क्लोन सही ढंग से तह/घुलनशील प्रोटीन के लिएएंकोडिंग/ के रूप में कई क्लोन, पुस्तकालय में मौजूद है और एक ही क्षेत्र/डोमेन में मानचित्रण, अलग शुरू और अंत अंक है, यह निष्पक्ष, एकल-ंयूनतम टुकड़े कि घुलनशील उत्पादों में परिणाम होने की संभावना है की एक कदम पहचान की अनुमति देता है ।
प्रौद्योगिकी में एक और सुधार NGS के उपयोग के लिए पुस्तकालय की विशेषताएं द्वारा दिया जाता है । इस मंच का संयोजन और डेटा विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट वेब उपकरण के सटीक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पर महत्वपूर्ण निष्पक्ष जानकारी देता है और आगे व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता के बिना अध्ययन के तहत संदर्भ डीएनए पर चयनित ORFs के स्थान पर या प्रायोगिक प्रयास ।
Domainome पुस्तकालयों एक चयन के संदर्भ में स्थानांतरित किया जा सकता है और कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए एक सार्वभौमिक साधन के रूप में इस्तेमाल किया । उच्च प्रवाह प्रोटीन अभिव्यक्ति और संपर्क विश्लेषण मंच है कि हम एकीकृत और है कि हम Interactome बुलाया Seq एक phagemid वेक्टर में फ़िल्टर ओआरएफ स्थानांतरित करके फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी का लाभ लेता है और एक फेज-ओआरएफ बनाने लायब्रेरी. एक बार फिर से एक फेज प्रदर्शन संदर्भ में क्लोन, प्रोटीन डोमेन M13 कणों की सतह पर प्रदर्शित कर रहे हैं; इस तरह domainome पुस्तकालयों सीधे जीन टुकड़े विशिष्ट एंजाइमी गतिविधियों या बाध्यकारी गुणों के साथ डोमेन एंकोडिंग के लिए चुना जा सकता है, की अनुमति interactome नेटवर्क की रूपरेखा । यह दृष्टिकोण शुरू में Zacchi एट अल द्वारा वर्णित किया गया था । 16 और बाद में कई अन्य प्रसंगों में प्रयुक्त13,17,18.
अंय प्रौद्योगिकियों प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया (सहित खमीर दो संकर प्रणाली और मास19स्पेक्ट्रोमेट्री,20), एक प्रमुख लाभ बाध्यकारी भागीदार है कि फेज के दौरान होता है के प्रवर्धन है की तुलना में चयन के कई राउंड प्रदर्शित करें । यह चयन संवेदनशीलता इस प्रकार कम प्रचुर मात्रा में बाध्यकारी प्रोटीन ‘ डोमेन पुस्तकालय में मौजूद की पहचान की अनुमति बढ़ जाती है । ओआरएफ-फ़िल्टर्ड पुस्तकालय के साथ प्रदर्शन के चयन की दक्षता और गैर कार्यात्मक क्लोन के अभाव की वजह से वृद्धि हुई है । अंत में, प्रौद्योगिकी चयन दोनों प्रोटीन और गैर प्रोटीन चारा21,22,23,24,25के खिलाफ प्रदर्शन करने की अनुमति देता है ।
domainome-फेज पुस्तकालय का उपयोग फेज सिलेक्शन विभिन्न रोग की स्थिति के साथ रोगियों के सीरा से आ रही एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है, जैसे स्व-प्रतिरक्षित रोग13, चारा के रूप में कैंसर या संक्रमण रोगों. इस दृष्टिकोण को तथाकथित “एंटीबॉडी हस्ताक्षर” के अध्ययन के तहत रोग के बड़े पैमाने पर पहचान करने के लिए अनुमति देने और प्रतिजनों/epitopes विशेष रूप से एक ही समय में रोगियों के एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अंय तरीकों की तुलना में फेज प्रदर्शन का उपयोग दोनों रैखिक और संरचना प्रतिजनी epitopes की पहचान की अनुमति देता है । एक विशिष्ट हस्ताक्षर की पहचान संभावित रोगजनन, नई वैक्सीन डिजाइन, नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और नए और विशिष्ट नैदानिक और शकुन उपकरणों के विकास को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । इसके अलावा, जब अध्ययन संक्रामक रोगों पर ध्यान केंद्रित किया है, एक प्रमुख लाभ यह है कि immunogenic प्रोटीन की खोज रोगज़नक़ खेती से स्वतंत्र है ।
हमारे दृष्टिकोण पुष्टि की है कि तह पत्रकारों को एक जीनोमिक पैमाने पर इस्तेमाल किया जा सकता है “domainome” का चयन करें: सही ढंग से तह का संग्रह, अच्छी तरह से व्यक्त की, घुलनशील प्रोटीन डोमेन से डीएनए और/ एक बार अलग प्रोटीन टुकड़े कई प्रयोजनों के लिए उपयोगी होते हैं, जीन एनोटेशन के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक जानकारी प्रदान करने के साथ ही संरचनात्मक अध्ययन के लिए, एंटीबॉडी epitope मानचित्रण, प्रतिजन पहचान, आदि उच्च प्रवाह NGS द्वारा उपलब्ध कराए गए आंकड़ों की पूर्णता ऐसे फेज प्रदर्शन पुस्तकालयों के रूप में अत्यधिक जटिल नमूनों, के विश्लेषण में सक्षम बनाता है, और करने के लिए पारंपरिक श्रमसाध्य उठा और व्यक्तिगत फेज बचाया क्लोन के परीक्षण को दरकिनार क्षमता रखती है ।
एक ही समय में फ़िल्टर पुस्तकालय की सुविधाओं के लिए धंयवाद और चरम संवेदनशीलता और NGS विश्लेषण की शक्ति के लिए, यह प्रोटीन एक प्रारंभिक स्क्रीन में सीधे प्रत्येक संपर्क के जिंमेदार डोमेन की पहचान संभव है, बनाने की आवश्यकता के बिना प्रत्येक सीमित प्रोटीन के लिए अतिरिक्त पुस्तकालयों । NGS किसी भी genic के पूरे domainome की एक व्यापक परिभाषा प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है/जीनोमिक शुरू स्रोत और डेटा विश्लेषण वेब उपकरण दोनों के एक गुणात्मक और मात्रात्मक दृष्टि से एक उच्च विशिष्ट लक्षण वर्णन के प्राप्यता सक्षम बनाता है interactome प्रोटीन्स ‘ गरिन्छ ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक उच्च गुणवत्ता अत्यधिक विविध ORFs फ़िल्टर पुस्तकालय के निर्माण के बाद से यह सभी पाइपलाइन के बाद के चरणों को प्रभावित करेगा पूरी प्रक्रिया में पहली महत्वपूर्ण कदम है ।
हमारे विधि का एक महत्वप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए शिक्षा और विश्वविद्यालय के इतालवी मंत्रालय (2010P3S8BR_002 से सीपी) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Sonopuls ultrasonic homogenizer | Bandelin | HD2070 | or equivalent |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | or equivalent |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | or equivalent |
| Molecular Biology Agarose | BioRad | 161-3102 | or equivalent |
| Green Gel Plus | Fisher Molecular Biology | FS-GEL01 | or equivalent |
| 6x DNA Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | or equivalent |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | or equivalent |
| Quick Blunting Kit | New England Biolabs | E1201S | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | or equivalent |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | or equivalent |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Sodium Acetate 3M pH5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| DH5aF' bacteria cells | Thermo Fisher Scientific | ||
| 0,2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1,5 ml tubes | general lab supplier | ||
| 0,1 cm electroporation cuvettes | Biosigma | 4905020 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y1003 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | EP0702 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| 150 mm plates | general lab supplier | ||
| 100 mm plates | general lab supplier | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| BssHII | New England Biolabs | R0199L | |
| NheI | New England Biolabs | R0131L | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | or equivalent |
| M13KO7 Helper Phage | GE Healthcare Life Sciences | 27-1524-01 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma-Aldrich | P5413 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| PBS | general lab supplier | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10003D | or equivalent |
| MagnaRack Magnetic Separation Rack | Thermo Fisher Scientific | CS15000 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Nonfat dried milk powder | EuroClone | EMR180500 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems, Fisher Scientific | 7958935001 | |
| AMPure XP beads | Agencourt, Beckman Coulter | A63881 | |
| Nextera XT dual Index Primers | Illumina | FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004 | |
| MiSeq or Hiseq2500 | Illumina | ||
| Spectrophotomer | Nanodrop | ||
| Agilent Bioanalyzer or TapeStation | Agilent | ||
| Forward PCR primer | general lab supplier | 5’ TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’ | |
| Reverse PCR primer | general lab supplier | 5’ TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’ | |
| Forward primer for NGS | general lab supplier | 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3’; | |
| Reverse primer for NGS | general lab supplier | 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3’; |
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