Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol
Summary
Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir “domainome” kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.
Abstract
Katlama gazetecilere olan katlama ve işlev tehlikeye kötü proteinler veya rasgele açık okuma çerçevesi katlama için erimiş zaman antibiyotik direnci gibi kolayca tanımlanabilen fenotipleri ile proteinlerdir. Biz nerede, TEM-1 β-lactamase (ampisilin direnci veriyor enzim) genomik bir ölçekte kullanarak, biz koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir intronless genom DNA kodlama bölümünden seçebilirsiniz bir strateji geliştirdik. “Domainome” olarak adlandırılan, bir yaklaşım elde edilen protein parçaları de ifade ve çözünür, yapısal/fonksiyonel çalışmalar için uygundur.
Klonlama ve “domainome” bir fajının görüntüleme sistemi içinde görüntüleyerek, biz böylece temel sağlamak istediğiniz bağlama özellikleri (Örneğin, diğer proteinler veya antikor), ile belirli protein etki alanlarını seçmek mümkün olduğunu göstermiştir deneysel bilgi için gen ek açıklama ya da antijen tanıma.
Seçili poliklonal popülasyonda en zenginleştirilmiş klonlar kimliği roman yeni nesil sıralama teknolojileri (NGS) kullanarak elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı biz derin sıralama Analizi kitaplığın kendisi ve çeşitlilik, bereket ve kesin haritalama her seçili parçasının üzerinde tam bilgi sağlamak için seçim çıkışlarını tanıtmak. Burada sunulan protokolleri Kütüphane inşaat, karakterizasyonu ve doğrulama için anahtar adımlar gösterir.
Introduction
Burada, inşaat ve kütüphanelerin katlanmış ve çözünür protein etki alanlarından herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak yelpazesi için yüksek üretilen iş yöntemi açıklanmaktadır. Yaklaşım üç farklı teknolojileri birleştirir: faj ekran, bir katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama (NGS) belirli web aracı ile kullanımı veri analizi için. Yöntemleri protein bazlı araştırma, birçok farklı bağlamlarda kullanılan kimlik ve ek açıklama yeni proteinler/protein etki alanlarının, yapısal ve işlevsel özellikleri bilinen proteinlerin yanı sıra tanımını karakterizasyonu için protein-etkileşim ağı.
Birçok açık sorular protein bazlı araştırma hala mevcut ve en iyi protein üretimi için yöntemler geliştirilmesi araştırma çeşitli alanları için önemli bir ihtiyaç. Örneğin, prokaryotik ve ökaryotik genleri1binlerce durumu rağmen göreli proteomes ilgili bir harita kodlu proteinleri ve peptidler doğrudan bir ek açıklama ile canlıların büyük çoğunluğu için yok. Tam proteomes kataloğu zaman ve kaynak açısından büyük bir çaba gerektiren zorlu bir hedef olarak ortaya çıkıyor. Deneysel ek açıklama için altın standart tüm açık okuma sözde “ORFeome” Bina çerçeveleri (ORFs) bir genomunun klonlama kalır. Homoloji bilinen faaliyet ilgili genlerle bağlı gen işlevi genellikle atanır ama bu yaklaşım birçok yanlış ek açıklamaları başvuru veritabanları2,3,4varlığı nedeniyle kötü doğru 5. Ayrıca, tespit ve açıklamalı bile için ek çalışmalar karakterizasyonu bolluk, yapısal ve işlevsel özellikleri de dahil olmak üzere farklı bağlamlarda ifade desen açısından elde etmek için gerekli proteinlerdir yanı sıra etkileşim ağları.
Ayrıca, farklı etki, her biri proteinler oluşur bu yana farklı protein işlevleri için katkı ve belirli özellikleri gösteren, çalışma ve bu etki alanlarının tam anlamını daha kapsamlı bir resim, her ikisi de tek izin verebilirsiniz Gen ve tam genom düzeyinde. Bu gerekli tüm bilgileri bir zorlu ve geniş alan protein bazlı araştırma yapar.
Bu açıdan tarafsız ve yüksek işlem hacmi yöntemlerle protein üretimi için önemli bir destek verilebilir. Ancak, bu tür yaklaşımlar, gerekli, önemli yatırım yanında başarısı yeteneği çözünür/stable protein yapıları üretmek için kullanır. Bu büyük bir sınırlayıcı faktör beri bu proteinlerin sadece yaklaşık % 30 başarılı bir şekilde dile getirdi ve deneysel olarak yararlı6,7,8olmak yeterli düzeylerde üretilen olduğunu tahmin ediyor. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım birlikte bireysel genler örtüşen parçası gösterimini sağlar farklı polipeptitler üretmek için rasgele parçalanmış DNA kullanımına dayanır. Rasgele oluşturulmuş DNA parçalarının sadece küçük bir yüzdesi vardır fonksiyonel ORFs ederken bunların büyük çoğunluğu non-görev (stop kodon onların dizileri içinde varlığı) nedeniyle veya orijinal dışında bir çerçeve içinde un doğal (ORF) için kodlar polipeptitler biyolojik anlamı ile.
Bu sorunlara yönelik olarak bizim grup üzerinde genomik ölçek9,10,11,12-ebilmek var olmak kullanılmış bir yüksek-den geçerek protein ifade ve etkileşim analizi platform geliştirmiştir. Aşağıdaki teknikler bu platforma entegre: 1) koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir organizma; kodlama DNA kısmından seçmek için bir yöntem 2) Ortaklar etkileşimlerin seçmek için fajının ekran teknolojisi; 3) NGS tamamen altında eğitim bütün interactome karakterize ve klonlar ilgi tanımlamak için; ve 4) veri analizi için kolay ve Kullanıcı dostu bir şekilde Interactome-Seq analizi yapmak herhangi bir Biyoinformatik veya programlama bilgisi olmayan kullanıcılar için bir web aracıdır.
Bu platform kullanımı araştırma alternatif stratejileri önemli avantaj sunar; Her şeyden önce tamamen tarafsız, yüksek-den geçerek ve sıra–dan tüm genom kadar tek bir gen çalışma için modüler bir yöntemdir. Boru hattı ilk adım altında eğitim, sonra derin NGS tarafından karakterize rastgele parçalanmış DNA kitaplıktan oluşturulmasıdır. Bu Kütüphane nerede genler/parçaları ilgi için protein salgılanması (yani, sn lideri) periplasmic uzaya bir sinyal serisi ve TEM1 β-lactamase gen arasında klonlanır mühendislik bir vektör kullanılarak oluşturulur. Füzyon proteini ampisilin direnç ve klonlanmış parçaları çerçeve varsa ampisilin baskı altında hayatta yeteneği görüşmek bu öğeleri ve elde edilen füzyon protein ile doğru katlanmış10,13 olduğunu ,14. Tüm klonlar klonlar sözde “filtre” antibiyotik seçimden sonra kurtarıldı, ORFs ve onları (% 80’den fazla) büyük bir çoğunluğu, gerçek genler9‘ dan türetilmiştir. Ayrıca, bu strateji gücünü tüm filtre ORF klonlar için doğru katlanmış/çözünür protein/etki alanları15Kodladığınız bulgular yer almaktadır. Gibi birçok klonlar, mevcut Kütüphane ve eşleme aynı bölge/etki alanında, farklı başlangıç ve bitiş noktaları, bu tarafsız, tek adım kimlik çözünür ürünlerinde sonuçlanması olası en küçük parçalar sağlar.
Teknoloji daha fazla bir düzelme NGS kullanımı ile Kütüphane karakterize etmek için verilir. Kombinasyonu bu platform ve veri analizi için belirli web aracının altında eğitim daha geniş analizleri, gerek kalmadan başvuru DNA üzerinde önemli tarafsız bilgi tam nükleotit dizileri ve seçili ORFs konumunu verir veya Deneysel çaba.
Domainome kütüphaneler bir seçim bağlam içine transfer ve fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için evrensel bir araç olarak kullanılan. Biz entegre ve Interactome-Seq aradık fajının ekran teknolojisi süzülmüş ORF phagemid vektör aktarmak ve faj ORF oluşturma yararlanır yüksek üretilen iş protein ifade ve etkileşim analizi platformu Kütüphane. Bir kez bir fajının görüntü içeriği, etki alanları M13 parçacıklar; yüzeyinde görüntülenir protein içine yeniden klonlanmış Bu şekilde domainome kütüphaneler doğrudan etki alanları belirli enzimatik faaliyetleri ile kodlama veya bağlama özellikleri, interactome ağlar profil oluşturma sağlayan gen parçaları için seçilebilir. Bu yaklaşım başlangıçta Zacchi vd tarafından tanımlanmıştır 16 ve daha sonra birkaç diğer içerik13,17,18içinde kullanılır.
Protein-protein etkileşim (Maya iki hibrid sistemi ve kütle spektrometresi19,20dahil) çalışma için kullanılan diğer teknolojileri ile karşılaştırıldığında, bir büyük avantaj sağlıyor fajının sırasında oluşur bağlama ortak amplifikasyon birden fazla mermi seçimi görüntüler. Bu böylece düşük bol bağlayıcı proteinler etki alanları Kitaplığı’nda tanımlaması izin seçim hassasiyeti artar. ORF filtre kitaplığı ile yapılan seleksiyonun verimini daha da işlevsel olmayan klonlar yokluğu nedeniyle artar. Son olarak, teknoloji protein ve protein yemler21,22,23,24,25karşı gerçekleştirilecek seçim sağlar.
Domainome-fajının kütüphaneyi kullanan fajının seçimleri farklı patolojik koşulları olan hastalarda, Örneğin otoimmün hastalıklar13, kanser ya da enfeksiyon hastalıkları sera yem olarak gelen antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım altında ağır tanımlamak ve özellikle aynı anda hastaların antikorlar tarafından tanınan antijenleri/epitopları karakterize etmek için izin vererek eğitim hastalığının sözde “antikor imza” elde etmek için kullanılır. Kullanımı diğer yöntemlerine göre faj doğrusal ve konformasyon antijenik epitopları tanımlaması görüntülenmesine izin verir. Belirli bir imza tanımlaması potansiyel olarak anlayış Patogenez, yeni aşı tasarım, yeni tedavi hedefleri tanımlaması ve belirli tanılama ve prognostik araçları gelişimi için önemli bir etkisi olabilir. Ayrıca, çalışma bulaşıcı hastalıklar üzerinde odaklanmış zaman immünojenik proteinler keşfi patojen ekimi bağımsızdır bir büyük avantaj sağlıyor.
Yaklaşımımız katlama gazetecilere genomik bir ölçekte “domainome” seçmek için kullanılabilir onaylar: doğru katlanmış, iyi ifade, çözünür protein etki DNA’ın kodlama bölümünden ve/veya herhangi bir organizmadan cDNA topluluğudur. Bir kez izole protein parçaları gen ek açıklama için de yapısal çalışmalar, antikor epitope eşleme, antijen tanıma, vbgelince gerekli deneysel bilgi veren birçok amaç için yararlıdır. NGS tarafından sağlanan yüksek üretilen iş veri bütünlüğü analiz fajının görüntü kitaplıkları gibi son derece karmaşık örnekleri sağlar ve geleneksel zahmetli malzeme çekme ve bireysel fajının kurtarıldı klonları test kaçınmak için potansiyele sahiptir.
Filtre uygulanmış Kütüphanesi ve aşırı duyarlılık ve güç NGS analiz özellikleri sayesinde aynı anda her etkileşimi doğrudan oluşturmak zorunda kalmadan bir başlangıç ekranı, sorumlu protein etki alanını tanımlamak mümkündür her biri için ek kütüphaneler protein bağlı. NGS sağlar herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak tüm domainome kapsamlı bir tanımını almak için ve veri çözümleme web aracı çok özel alan nitelik özellikleri her iki açıdan bir nitel ve nicel elde sağlar interactome protein etki alanları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Boru hattı tüm sonraki adımları etkileyecek bu yana, bir yüksek kaliteli son derece çeşitli ORFs filtre uygulanmış Kütüphane tüm prosedürü içinde belgili tanımlık ilk kritik adım oluşturulmasıdır.
Bizim Yöntem önemli bir avantajlı özelliği herhangi bir kaynak (intronless) DNA (cDNA, genomik DNA, elde edilen PCR veya sentetik DNA) kütüphane yapımı için uygun olmasıdır. Dikkate alınması gereken ilk pFILTER vektör klonlanmış DNA parçalarının uzunluğu geno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser İtalyan Milli Eğitim Bakanlığı ve üniversite bir hibe tarafından desteklenmiştir (CP için 2010P3S8BR_002).
Materials
| Sonopuls ultrasonic homogenizer | Bandelin | HD2070 | or equivalent |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | or equivalent |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | or equivalent |
| Molecular Biology Agarose | BioRad | 161-3102 | or equivalent |
| Green Gel Plus | Fisher Molecular Biology | FS-GEL01 | or equivalent |
| 6x DNA Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | or equivalent |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | or equivalent |
| Quick Blunting Kit | New England Biolabs | E1201S | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | or equivalent |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | or equivalent |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Sodium Acetate 3M pH5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| DH5aF' bacteria cells | Thermo Fisher Scientific | ||
| 0,2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1,5 ml tubes | general lab supplier | ||
| 0,1 cm electroporation cuvettes | Biosigma | 4905020 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y1003 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | EP0702 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| 150 mm plates | general lab supplier | ||
| 100 mm plates | general lab supplier | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| BssHII | New England Biolabs | R0199L | |
| NheI | New England Biolabs | R0131L | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | or equivalent |
| M13KO7 Helper Phage | GE Healthcare Life Sciences | 27-1524-01 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma-Aldrich | P5413 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| PBS | general lab supplier | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10003D | or equivalent |
| MagnaRack Magnetic Separation Rack | Thermo Fisher Scientific | CS15000 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Nonfat dried milk powder | EuroClone | EMR180500 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems, Fisher Scientific | 7958935001 | |
| AMPure XP beads | Agencourt, Beckman Coulter | A63881 | |
| Nextera XT dual Index Primers | Illumina | FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004 | |
| MiSeq or Hiseq2500 | Illumina | ||
| Spectrophotomer | Nanodrop | ||
| Agilent Bioanalyzer or TapeStation | Agilent | ||
| Forward PCR primer | general lab supplier | 5’ TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’ | |
| Reverse PCR primer | general lab supplier | 5’ TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’ | |
| Forward primer for NGS | general lab supplier | 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3’; | |
| Reverse primer for NGS | general lab supplier | 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3’; |
References
- Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
- Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).
- Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).
- Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).
- Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
- Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
- DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
- Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
- Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).
- Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
- D’Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
- D’Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
- Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
- Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
- Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
- Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
- Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
- Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
- Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
- Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
- Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
- Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta – Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
- Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).
- Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
- Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
- Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
- Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
- D’Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
- Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
- D’Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
