小鼠视网膜色素上皮细胞的原代培养
Summary
视网膜色素上皮 (RPE) 是一种多功能的眼睛上皮。在这里, 我们提出了建立从小鼠视网膜色素形成的主要细胞培养的协议。
Abstract
视网膜色素上皮 (RPE) 是一种高度极化的多功能上皮, 位于神经视网膜和眼脉络之间。这是一个单一的色素细胞, 是六边形包装和连接紧密交界处。视网膜色素的主要功能包括光的吸收、棚感光外段的吞噬、离子的空间缓冲、养分的输送、离子和水以及在视觉循环中的积极参与。对视网膜色素上皮细胞的生物学研究具有重要而多样的作用。已经建立了一些视网膜色素上皮细胞系;然而, 传代和永生化细胞很快就失去了自然视网膜色素细胞的一些形态学和生理特性。因此, 主细胞更适合研究视网膜色素上皮细胞生物学和功能的不同方面。小鼠原发性视网膜色素上皮细胞培养对研究人员非常有用, 因为小鼠模型在生物研究中被广泛应用, 然而从老鼠那里采集视网膜色素细胞也很有挑战性, 因为它们的体积小。在这里, 我们提出了建立主要的小鼠 RPE 细胞培养的协议, 包括眼睛的摘除和解剖和视网膜色素表的分离, 以产生细胞培养。此方法可实现有效的单元恢复。从两个小鼠获得的 RPE 细胞可以达到融合在一个12毫米聚酯膜插入预加载的文化板块后, 一个星期的文化, 并显示一些原始的性质, 如六角形和色素沉着在两个周的文化。
Introduction
视网膜色素上皮 (RPE) 是一个单一层的极化上皮细胞位于神经视网膜和脉络膜之间的眼睛。视网膜色素上皮细胞的功能和 rpe 单层的完整性对视力是至关重要的, 因为视网膜色素上皮在维持外血-视网膜屏障、水和离子在视网膜之间的传输等多个过程中起着重要作用。脉络膜, 光吸收, 保护免受氧化应激, 控制甲酸代谢, 和吞噬的外部部分的感光细胞1,2。视网膜色素在眼睛后的位置, 以及它的屏障功能, 防止药物管理系统地从血液传递到玻璃体的幽默, 使人们很难研究视网膜色素功能在体内的复杂性。因此, 很有必要建立视网膜色素细胞培养, 以研究在一个灵活的, 受控环境中的 rpe 细胞3,4。
有许多已建立的 RPE 细胞线存在, 提供了一种方便和方便的方式获取和储存的细胞;但是, 与主单元格2、3、4相比, 传代单元格有一些缺点。首先, 它们通常以细胞形态学的变化为特征。例如, 由于细胞极性表型的丧失和紧连接的部分消失4, 现有的细胞系都没有发现适合于对 RPE 屏障特性进行可靠的研究。除了极性的丧失和细胞对细胞的正常连接外, 视网膜色素上皮细胞系由于在成人视网膜色素沉着5中没有关键的黑酶而迅速失去色素。色素沉着可以恢复, 但对重新着色机制的综合分析, 将包括透射电镜, 基因表达分析和化学化验的结合, 以确认黑色素的存在从来没有已执行6。还有一个限制是视网膜色素上皮细胞系延长了细胞的寿命 (有时是不朽的), 在某些条件下, 可以转化为自更新的多能干细胞, 分离出基质, 形成漂浮的菌落7,8. 这一限制使得无法使用细胞系进行移植实验3。
考虑到已建立的视网膜色素细胞系的缺点, 从新鲜组织获得的原发性视网膜色素上皮细胞培养可能成为研究视网膜色素的一种更具生物学意义的模型。主要的视网膜色素细胞不仅用于研究视网膜色素特异功能, 如维生素 A 代谢9, 感光外段的吞噬作用10和离子传输11, 但也研究基本细胞生物学, 如上皮细胞极性2 , 溶酶体稳态和自噬12,13。
在过去的几年中, 有许多关于建立主要视网膜色素培养的出版物, 表明对这一研究领域的兴趣越来越浓厚3,14,15。许多人类视网膜色素细胞和非人类视网膜色素上皮细胞的协议, 如牛和猪视网膜色素上皮细胞被发布了16,17,18,19。然而, 由于它们的体积小得多, 所以处理小鼠视网膜色素细胞更加困难。尽管相当多的出版物已经描述了将 rpe 细胞从鼠标14、20、21中隔离出来的协议, 但仍有许多研究人员在努力隔离 rpe 细胞而不神经视网膜碎片对脉络膜细胞或细胞的污染。在这里, 我们提出了建立主要的小鼠 RPE 细胞培养的协议, 包括从老鼠的眼睛, 眼睛的解剖和视网膜色素表的分离, 以获得细胞培养。该视频协议将特别有用的研究员谁开始工作的小鼠主要视网膜色素培养和需要指导的解剖技术。
Protocol
Representative Results
Discussion
所提出的详细协议能够可靠地建立在1周后到达融合的小鼠原发性视网膜色素培养物, 并在2周后呈现主要的视网膜色素特征, 如六角形和色素沉着。所获得的 RPE 细胞可用于一些下游应用, 如维生素 a 代谢9, 感光外段的吞噬功能10和离子传输11, 上皮细胞极性2, 溶酶体稳态和自噬12,13。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由 BrightFocus 基金会 (DS) 部分资助。
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
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