מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד
Summary
לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.
Abstract
הגיוס של לויקוציטים בעת פציעה או דלקת לאתרים של פציעה או נזק לרקמות נחקר במהלך העשורים האחרונים, הביא הרעיון של המפל אדהזיה ליקוציט. עם זאת, המנגנון המולקולרי המדויק מעורב ליקוציט גיוס לא עדיין מלא זוהו. מאז הגיוס ליקוציט נותר נושא חשוב בתחום של זיהום, דלקת, ומחקר (auto-) המערכת החיסונית, אנו מציגים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה ללמוד מנגנונים הבסיסית של הדבקה, אדהזיה ולהשתחרר, ו גלגול של לויקוציטים תחת משטרים ורידים, עורקים זרימה. וזמינותו במבחנה ניתן ללמוד את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם במודלים שונים של דלקת בכלי הדם. פרוטוקול זה מתאר assay מבוסס זרימה שכבתית באמצעות תא במקביל זרימה במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוכה מחובר מצלמה ללמוד את האינטראקציות של לויקוציטים, תאי אנדותל או טסיות הדם, אשר ניתן דמיינו הוקלט אז ניתח באופן לא מקוון. תאי אנדותל, טסיות דם או לויקוציטים יכול להיות pretreated עם מעכבי או נוגדנים כדי לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות בתהליך זה. הטיה תנאים, דהיינו עורקי או ורידי גזירה, ניתן להתאים בקלות על ידי צמיגות ו קצב זרימה של נוזלים perfused, ואת הגובה של הערוץ.
Introduction
על פציעה, דלקת או זיהום, לויקוציטים להגיב במהירות כדי פתוגן או נזק-הקשורים מולקולרית דפוסי (PAMPs, DAMPs), לשנות את מצב מופעל ועל העברת מחוץ לזרם הדם לאתרים של דלקת ברקמות נזק. היכולת של לויקוציטים לאינטראקציה עם הסביבה תאית ומולקולרית שלהם חיוני לתפקוד הנכון שלהם כמו תאים חיסוניים, כפי שמודגש על ידי הפרעות גנטיות כגון ליקוציט אדהזיה מחסור1. ליקוציט אדהזיה כבר הנושא של החקירה אינטנסיבי במהלך העשורים האחרונים, כתוצאה מכך הרעיון של המפל אדהזיה ליקוציט בתחילת שנות ה-902,3. אדהזיה ליקוציט הוא שיזם התפיסה בחירת שמלות בתיווך של לויקוציטים כדי אנדותל, גורם לתאים לגלגל על פני כלי הדם. זה מתגלגל מאפשר לויקוציטים לסריקה אנדותל מכורך רמזים נודדות, למשל, נוגדנים, אשר זירוז הפעלת אינטגרינים. לאחר מכן, הפעלת אינטגרינים מתווכים האיגוד על ליגנדים אנדותל, וכתוצאה מכך ליקוציט המשרד מעצר. לויקוציטים יכול לאחר מכן התכונן בורחת על ידי זוחלים והפצת, לפני חדירה של טפט אנדותל, transmigrating לתוך הרקמה הבסיסית. התפיסה הבסיסית של המפל ליקוציט הקנוני נשאר ברובו ללא שינוי מאז השקתו, עם מדרגות ביניים להוסיף4. ובכל זאת, את המנגנונים המולקולריים המדויק ואת התפקידים של השחקנים הרבים המעורבים ליקוציט הגיוס יש לא הובהרו עד כה, ונשאר גיוס ליקוציט מהווים נושא חשוב בתחום של זיהום, דלקת, ועמיד (auto) מחקר.
לדוגמה, במהלך מחלות דלקתיות בכלי הדם כגון טרשת עורקים, גדל ליקוציט גיוס לתוך התפתחות רובד כלי כוננים קיר. הפלאק טרשת עורקים לא יציב ייתכן קרע, מובילה להפעלה מסיבית של טסיות הדם, במערכת קרישת הדם, ולאחר מכן ל סגר של כלי השיט5. זה עלול לגרום לתוצאות לב וכלי דם חמורים כגון אוטם שריר הלב או שבץ מוחי. בנוסף, אנדותל חסיפה כפי שהיא מתרחשת קלינית, למשל לאחר סטנט של עורק כלילי, מוביל אל שפע של אינטראקציות של לויקוציטים, טסיות הפנים קיר הספינה החשוף (למשל, מטריקס רכיבים וחלקה. שרירים תאים) של לויקוציטים עם טסיות כיסוי הפגיעה בכלי הדם. אינטראקציות אלה חשובים להמשך פיתוח של המחלה כפי מונוציט-טסיות אינטראקציות שאסע neointima היווצרות6,7. בנוסף, טסיות-ליקוציט אינטראקציות מתווכת על-ידי ליקוציט אינטגרין Mac-1 (αMβ2), טסיות GPIbα לאחרונה זוהו מנהלי התקנים הרומן של פקקת עכברים8.
לאור זמינותו רחב של דם האדם ושל בעלי החיים כמקור של לויקוציטים ולבנים וטסיות דם עבור המחקר ואת הספקטרום הרחב של מטריקס מבודד מולקולות וקווים מונצחים תא של ליקוציט ולמקור כלי דם, זה ריאלי כדי לדמות ליקוציט אינטראקציות תחת זרימה בתוך מעבדה הגדרת, באמצעות זרימת שתוכנן במיוחד זלוף צ’יימברס. וריאציות רבות עוצבו העשורים האחרונים, החל מונחה ואקום ללשכה זלוף דביק. כל הווריאציות יש במשותף זה החלק משותק (למשל, בתרבית תאים וסקולרית או מטריצה חלבונים) התכנסה לתוך תא עמיד בפני נזילה גדול מאובזר עם ערוץ מוגדרים מראש ומאפשרת זלוף של נוזלים על החלק משותק. בנוסף, ההתקדמות שהמודעות הטכנולוגיה אפשרה פיתוח פתרונות התפורים מבוססת על פולימרים סיליקה9. צמיגות ואת קצב זרימה של נוזלים perfused, ואת הגובה של הערוץ בעיקר לקבוע מאפייני זרימה זלוף התקן10גזירה. במאמר זה, נציג של שיטת במבחנה ללמוד מנגנונים הבסיסית של הדבקה, דה- אדהזיה ולאחר גלגול של לויקוציטים תחת משטרים ורידים, עורקים זרימה. היתרון של השיטות המובאות כאן היא כי יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופ מחוברת זריחה נפוצות והם אינם מחייבים ניסויים בעל מיומנות טכנית גבוהה. וזמינותו במבחנה ניתן לטפל בדרכים רבות (למשל, על-ידי הוספת מעכבי או חסימת נוגדנים), ולכן הרלוונטיים במודלים שונים של דלקת כלי הדם ואת מאפשר החקירה של אדהזיה חלבון פונקציות או הערכה של תרכובות ייעודיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה וזמינותו במבחנה היא שיטה פשוטה כדי לחקור מנגנונים הבסיסית של ליקוציט הגיוס בעת דלקת כלי הדם, אבל יש כמה נקודות קריטיות שיירשמו. הדרישה הראשונה לביצוע בהצלחה assay הזה הוא זלוף של לויקוציטים ללא פגע, confluent וסקולרית או טסיות טפט. זו יכולה להיות מושגת על ידי מוקדמת ציפוי של המשטחים עם קול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד”ר מרטין מ שמיט, קו Fraemohs. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הולנד למחקר מדעי (אני אגיד להם ZonMW 016.126.358 לנדשטיינר קרן למחקר עירוי דם (LSBR Nr. 1638), פתוח (SFB1123/A2) הוענק R.R.K.
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
