כרומטין יליד Immunoprecipitation באמצעות המוח מאתר הגידול Neurospheres
Summary
מנגנוני epigenetic משתנים לעתים קרובות ב glioma. כרומטין immunoprecipitation יכול לשמש כדי לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים ב glioma הנובעות משינויים שינויים היסטון המסדירה שעתוק גנים ומבנה כרומטין. פרוטוקול זה מתאר כרומטין יליד immunoprecipitation על המוח מאתר הגידול neurospheres.
Abstract
שינויים epigenetic עשוי להיות מעורב של התפתחות והתקדמות של glioma. שינויים מתילציה וכן acetylation של היזמים ואזורים הרגולציה של oncogenes, מדכאי הגידול יכול להוביל שינויים בביטוי הגנים, יש תפקיד חשוב בפתוגנזה של גידולים במוח. כרומטין מקורי immunoprecipitation (ChIP) היא טכניקה פופולרית המאפשרת זיהוי שינויים או חלבונים אחרים הלחוצים ל- DNA. בניגוד לשבב צולבים, יליד שבב, התאים לא מטופלים עם פורמלין לקשר covalently חלבון ל- DNA. זה יתרון כי לפעמים crosslinking עלולה לתקן את החלבונים בלבד transiently אינטראקציה עם ה-DNA, אין משמעות תפקודית הכונה. בנוסף, בדרך כלל גדלים נוגדנים נגד פפטידים מבולבל. לכן, ירידה לפרטים נוגדן מתגברת בשבב מקורית. עם זאת, חשוב לזכור כי השבב יליד ישימה רק ללמוד שינויים היסטוניים או חלבונים אחרים בחוזקה לאגד את הדנ א. פרוטוקול זה מתאר את immunoprecipitation כרומטין מקורית על המוח מאתר הגידול neurospheres.
Introduction
אירועים epigenetic שכיחים ב gliomas, סביר לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה הגידול. אכן, ילדים glioma בדרגה גבוהה, מוטציות בגנים קידוד היסטון גרסאות H3.3 ו- H3.1 מתרחשים לעתים קרובות1. מוטציות משפיעות על שינויים היסטון ויש השלכות epigenetic הגדולות2,3. הנער המתבגר לקשת למבוגרים, חוזרים ונשנים מוטציות בגן isocitrate דהידרוגנאז 1/2 (IDH1/2), מוטציה אשר מעכב α-ק ג היסטון תלויים ו- DNA דה-methylasaes, שינויים גנטיים של הרגולטורים כרומטין אחרים כגון ATRX ו- DAXX מתרחשים 4. לכן, יש חשיבות קריטית כדי ללמוד איך מוטציות המשפיעות על הרגולטורים epigenetic לשנות הכרומטין ושינויים רגולטוריים היסטון, אשר, בתורו, יש השפעה דרמטית של transcriptome של תאי הגידול.
Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) הוא כלי רב עוצמה המשמש כדי להעריך את ההשפעה של שינויים epigenetic הגנום6,5,, או7. בצ’יפ מקורי, כרומטין מתעכלת עם נוקלאז micrococcal (MNase), immunoprecipitated באמצעות נוגדן שהועלו כנגד החלבון של עניין, ולאחר מכן הדנ א הוא מטוהרים מורכבים כרומטין6immunoprecipitated. התאים אינם מתוקנים במהלך ההליך אז טכניקה זו ישימה רק לצורך המחקר של חלבונים המקיימים אינטראקציה באופן הדוק עם דנ א6. העדר cross-linking עזרי נוגדן ירידה לפרטים מאז נוגדנים גדלים בדרך כלל נגד פפטידים או חלבונים מבולבל7. בנוסף, מכיוון שאין שום צעד cross-linking, זה מפחית את הסיכוי של תיקון אינטראקציות חלבון-אן ארעי, כי הם לא ספציפית ותקינה לא7,8. שבב יכול לשמש כדי לזהות את העשרת של היסטון שינויים באזור גנומית מסוים. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול עבור ביצוע צ’יפ מקורי ב- neurospheres (NS) המופקים גנטית מהונדסים העכבר מודלים של glioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המובאת כאן יאפשר למשתמש לבצע צ’יפ מקורי-NS נגזר גידולים במוח מהונדסים גנטית. בניגוד cross-linking שבב, פרוטוקול זה מוגבל לצורך המחקר של חלבונים המשייכים בחוזקה דנ א6. ניתן לשנות את מספר התאים להשתמש לפי הצורך, וניתן לשנותם הפרוטוקול. השתמשנו עונה 1 פרק 106 תאי ה-IP, עם זאת, י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות/לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות & קו (NIH/NINDS) מענקים R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 כדי M.G.C.; NIH/NINDS מעניקה R01-NS076991 R01-NS082311, R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; במחלקה הנוירוכירורגית; של לאה לבבות שמח ואת קרן למרות צ’אד M.G.C. P.R.L. RNA וההתערבות גרנט F046166 כדי M.G.C. F.M.M. נתמך על ידי F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. הוא נתמך על ידי NIH / NIGMS הענק 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
References
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
