रासायनिक विकार विधियों के प्रयोग से हेपेटाइटिस ई वायरस नैनोकणों की सतह Functionalization
Summary
हम एक theranostic nanoparticle (HEVNP) के रूप में हेपेटाइटिस ई वायरस के कैप्सिड प्रोटीन इंजीनियर है । HEVNP श्लैष्मिक डिलीवरी में एक स्थिर icosahedral पिंजरे में सेल्फी इक्ट्ठा करते हैं । यहां, हम cysteines के लिए सतह उजागर अवशेषों को बदलना द्वारा ट्यूमर लक्ष्यीकरण के लिए HEVNPs के संशोधन का वर्णन है, जो सिंथेटिक लाइगैंडों कि विशेष रूप से बांध ट्यूमर कोशिकाओं संयुग्मी ।
Abstract
वायरस जैसे कणों (VLPs) का इस्तेमाल विदेशी epitopes को प्रदर्शित करने के लिए nanocarriers के रूप में किया गया है और विभिन्न रोगों का पता लगाने और उपचार में छोटे अणुओं उद्धार/ यह आवेदन रिकॉमबिनेंट VLPs के ट्यूमर लक्ष्यीकरण आवेदन को पूरा करने के लिए आनुवंशिक संशोधन, स्व-विधानसभा, और cysteine विकार पर निर्भर करता है. अकेले आनुवंशिक संशोधन के साथ तुलना में, विकार करने के लिए विदेशी पेप्टाइड्स के रासायनिक VLPs एक महत्वपूर्ण लाभ क्योंकि यह संस्थाओं की एक किस्म की अनुमति देता है, ऐसे सिंथेटिक पेप्टाइड्स या oligosaccharides के रूप में, VLP विधानसभा के परिवर्तन के बिना एक संग्राहक और लचीला तरीके से VLPs की सतह के लिए संयुग्मित हो ।
यहां, हम प्रदर्शन कैसे हेपेटाइटिस ई वायरस nanoparticle (HEVNP), एक मॉड्यूलर theranostic कैप्सूल, एक बहुआयामी प्रसव वाहक के रूप में उपयोग करने के लिए । HEVNPs के कार्य ऊतक लक्ष्यीकरण, इमेजिंग, और चिकित्सकीय वितरण शामिल हैं । HEVNP की अच्छी तरह से स्थापित संरचनात्मक अनुसंधान के आधार पर, संरचनात्मक रूप से स्वतंत्र और सतह उजागर अवशेषों thiol-चुनिंदा लिंकेज के माध्यम से maleimide-लिंक्ड रासायनिक समूहों के लिए विकार साइटों के रूप में cysteine प्रतिस्थापन के लिए चुना गया था । एक विशेष cysteine संशोधित HEVNP (५७३ एए (HEVNP-573C) में asparagine के एक Cys प्रतिस्थापन) एक स्तन कैंसर कोशिका के लिए संयुग्मित था विशिष्ट ligand, LXY30 और पास के साथ लेबल-अवरक्त (NIR) प्रतिदीप्ति डाई (cy 5.5), ट्यूमर प्रतिपादन-लक्षित HEVNPs के रूप में प्रभावी नैदानिक कैप्सूल (LXY30-HEVNP-cy 5.5) । इसी तरह इंजीनियरिंग रणनीतियों अच्छी तरह से ज्ञात परमाणु संरचनाओं के साथ अंय macromolecular परिसरों के साथ नियोजित किया जा सकता है theranostic वितरण में संभावित अनुप्रयोगों का पता लगाने ।
Introduction
नैनो के विकास-चिकित्सीय और नैदानिक वितरण, nanotheranostics के रूप में जाना में वैक्टर आकार, जैव चिकित्सा क्षेत्र के ज्यादा स्थानांतरित कर दिया है लक्षित प्रसव के प्रति सामान्यीकृत उपचार से दूर1। लक्षित nanotheranostic डिलिवरी नैनो आकार वैक्टर (नैनोकणों) theranostic अणुओं के साथ एक विशिष्ट रोगग्रस्त ऊतक या जैव रासायनिक मार्ग के लिए छुरा प्रत्यक्ष theranostic अणुओं को एकीकृत करता है2,3,4 . Nanomedicine लक्षित प्रसव के सबसे आगे आ गया है क्योंकि इष्टतम आकार नैनोकणों क्षमता के लिए theranostic अणुओं के संचलन को स्थिर है और चुनिंदा कोशिकाओं की सतह रोगग्रस्त ऊतकों पर प्रस्तुत अणुओं । कई nanotheranostic प्लेटफार्मों अभी भी निष्क्रिय कोशिका के ऊपर से पीड़ित, पूर्व परिपक्व गिरावट, विषाक्तता, और theranostic अणुओं के साथ अपर्याप्त सहयोग । VLPs लक्षित वितरण में इन बाधाओं के कई दूर । वे nanocarriers के रूप में इस्तेमाल किया गया है के लिए विदेशी epitopes प्रदर्शन और/या छोटे अणुओं उद्धार: एक आहार है कि कई रोगों से निपटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है1। इस आवेदन में मुख्य रूप से आत्म विधानसभा की संपत्ति पर निर्भर करता है के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक संशोधनों की आसानी, दिए गए VLP के लिए डिजाइन आवेदन को पूरा करने के लिए. आनुवंशिक इंजीनियरिंग की तुलना में, VLP के लिए विदेशी पेप्टाइड्स के रासायनिक विकार एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदर्शित करता है क्योंकि यह संस्थाओं की एक महान विविधता की अनुमति देता है, जैसे पेप्टाइड्स या oligosaccharides, एक संग्राहक में VLPs की सतह के लिए संयुग्मित किया जा करने के लिए और VLP विधानसभा के परिवर्तन के बिना लचीला तरीके से ।
HEVNPs, रिकॉमबिनेंट HEV कैप्सिड प्रोटीन, 2एनडी ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF2) से व्युत्पंन, गैर संक्रामक, स्व-सेल बाध्यकारी और प्रवेश के capsids में सक्षम कोडांतरण हैं । क्योंकि HEV श्लैष्मिक संचरण के लिए विकसित, इकट्ठे कैप्सिड प्रोटीन proteolytic और अम्लीय श्लैष्मिक स्थितियों में इसी तरह स्थिर है5. HEVNPs फार्म एक खोखले, टी = 1 icosahedral कैप्सिड, ६० समान इकाइयों6से बना है,ORF2 के7 , यह बहुत भंडारण में और कठोर शारीरिक स्थितियों में दोनों स्थिर प्रतिपादन । किसी भी वायरल आनुवंशिक तत्वों की कमी, कुशल, उच्च उपज उत्पादन कीट कोशिकाओं में baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से हासिल की है । क्योंकि उनके proteolytic स्थिरता, स्व इकट्ठे HEVNPs निकाले जाते है और कोशिका supernatant से शुद्ध, काफी आवश्यक शुद्धि चरणों को कम करने । इसके अतिरिक्त, HEVNPs एक सतह उजागर दखल डोमेन (पी डोमेन) एक स्थिर icosahedral आधार के लिए एक लचीला काज के माध्यम से जुड़ा है । पी डोमेन रूपों सतह उजागर icosahedral आधार के ऊपर spikes जबकि लचीला काज यह महत्वपूर्ण आधार icosahedral संरचना समझौता किए बिना पी डोमेन को संशोधित करने के लिए संभव बनाता है । ६० दोहराया इकाइयों के साथ, एक साइट-रासायनिक मॉडुलन के लिए ६० सममित साइटों में विशिष्ट संशोधन के परिणाम । हाल ही में, हम एक नैनो-HEVNP का उपयोग कर मंच है कि रासायनिक theranostic अनुप्रयोगों के लिए लाइगैंडों या छोटे अणुओं संयुग्मी कर सकते है का प्रस्ताव किया । यह maleimide-लिंक्ड पेप्टाइड्स या अणुओं के साथ एक प्रतिक्रिया साइट के रूप में HEV-VLP के दखल डोमेन पर cysteine के साथ एक एकल एमिनो एसिड की जगह से प्राप्त किया गया था । HEV के पिछले संरचनात्मक विश्लेषण के आधार पर-VLP और अच्छी तरह से अध्ययन immunogenic epitopes8,9, निंनलिखित पांच HEV-VLP अमीनो एसिड संभावित उंमीदवारों के रूप में cysteine के साथ प्रतिस्थापित किया गया: Y485C, T489C, S533C, N573C, और T586C ( चित्र 1) । कीट कोशिकाओं से अभिव्यक्ति और शुद्धि के बाद, उनके VLP संरचनाओं संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) अवलोकन (चित्रा 2) द्वारा पुष्टि की गई, और उजागर cysteine साइटों maleimide से जुड़े बायोटिन के बाद पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किया गया विकार (चित्र 2) । पांच म्यूटेंट के अलावा, HEVNP-573C maleimide के सबसे मजबूत संकेत-बायोटिन विकार (चित्रा 2) प्रदर्शित और स्तन कैंसर सेल के लिए nanocarrier के रूप में प्रदर्शन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था4 (चित्रा 3लक्ष्यीकरण ।
यह प्रोटोकॉल रासायनिक विकार तरीकों को दर्शाया गया है कि ट्यूमर-लक्ष्यीकरण अणुओं को सतह cysteine विकार के माध्यम से HEVNPs में संलग्न करें । हम विस्तार ट्यूमर लक्ष्यीकरण और रिकॉमबिनेंट HEVNPs के साथ ट्यूमर के वितरण के लिए पता लगाने के अणुओं के विकार पर एक cysteine युक्त N573 (HEVNP-573C). हम एक दो कदम पर क्लिक करें रसायन विज्ञान विकार प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक स्तन कैंसर ट्यूमर लक्ष्यीकरण पेप्टाइड, LXY30 के लिए10 HEVNPs करने के लिए फार्म LXY30-HEVNP (चित्रा 4) । इसके बाद, N-hydroxysuccimide (एन एच एस)-cy 5.5 HEVNPs पर अलग Lys साइट के लिए LXY30-HEVNP-cy 5.5 दोनों विट्रो में (चित्रा 5) और vivo में4 का पता लगाने के लिए बनाने के लिए संयुग्मित थे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
समय लेने आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रक्रिया है, जो आम तौर पर हफ्तों लगते है इसके विपरीत, यहां हम सरल दो कदम और एक कदम रासायनिक विकार प्रक्रियाओं, जो 3 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है, कैंसर लक्ष्यीकरण जोड़…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक NIH अनुदान द्वारा RHC को धन के प्रायोजन स्वीकार # ‘ s: AI095382, EB021230, CA198880, राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान, साथ ही फिनलैंड के प्रतिष्ठित प्रोफेसर कार्यक्रम ।
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
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