Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica
Summary
Abbiamo progettato la proteina del capside del virus di epatite E come una nanoparticella di teranostici (HEVNP). HEVNP auto-assembla in una gabbia icosahedral stabile nella consegna delle mucose. Qui, descriviamo la modifica di HEVNPs per tumore targeting modificando la superficie esposta residui di cisteine, che coniuga ligandi sintetici che legano specificamente le cellule del tumore.
Abstract
Particelle simili al virus (VLPs) sono state usate come nanovettori Visualizza epitopi stranieri e/o consegnare piccole molecole nella rilevazione e nel trattamento di varie malattie. Questa applicazione si basa sulla modificazione genetica, auto-assemblaggio e coniugazione di cisteina per soddisfare l’applicazione targeting tumorale del ricombinante VLP. paragonati genetica coniugazione di chimica, da sola modificazione di peptidi stranieri a VLPs offre un significativo vantaggio, perché permette una varietà di soggetti, quali peptidi sintetici o oligosaccaridi, per essere coniugato alla superficie di VIP in modo modulato e flessibile senza alterazione dell’Assemblea VLP.
Qui, noi dimostrare come utilizzare l’epatite E virus nanoparticelle (HEVNP), una capsula di teranostici modularizzato, come un vettore di consegna multifunzionale. Funzioni di HEVNPs includono tessuto-targeting, imaging e consegna terapeutico. Basato sulla consolidata ricerca strutturale di HEVNP, i residui strutturalmente indipendenti e superficie-esposta sono stati selezionati per la sostituzione di cisteina come siti di coniugazione per gruppi chimici maleimide-collegato tramite legami tiolo-selettivo. Un particolare cisteina-modificato HEVNP (una sostituzione di Cys dell’asparagina a 573 aa (HEVNP – 573C)) è stato coniugato ad un ligando di cellula-specifico di cancro di seno, LXY30 e marcati con vicino infrarosso (NIR) fluorescenza colorante (CY 5.5), rendendo il targeting per tumore HEVNPs come efficace diagnostiche capsule (LXY30-HEVNP-CY 5.5). Simili strategie di ingegneria possono essere impiegate con altri complessi macromolecolari con ben noti strutture atomiche per esplorare potenziali applicazioni in teranostici consegna.
Introduction
Lo sviluppo di vettori di dimensioni nanometriche in consegna terapeutica e diagnostica, conosciuto come nanotheranostics, ha spostato gran parte del campo biomedico lontano da trattamenti generalizzate verso mirati consegna1. Nanotheranostic mirati consegna integra dimensioni nano vettori (nanoparticelle) con molecole teranostici stabilmente dirigere teranostici molecole di uno specifico tessuto malato o via biochimica2,3,4 . La nanomedicina è venuto alla ribalta della somministrazione mirata perché in modo ottimale dimensioni nanoparticelle hanno la capacità di stabilizzare la circolazione delle molecole teranostici e mirare selettivamente molecole di superficie cellulare presentati su tessuti malati. Molte piattaforme di nanotheranostic soffrono ancora di uptake cellulare passiva, degradazione prematura, tossicità e insufficiente collaborazione con molecole teranostici. VLP superare molti di questi ostacoli in somministrazione mirata. Sono stati utilizzati come nanovettori Visualizza epitopi stranieri e/o consegnare piccole molecole: un regime che può essere usato per combattere molte malattie1. Questa applicazione si basa principalmente sulla proprietà di auto-assemblaggio così come la facilità di modificazioni genetiche, per soddisfare l’applicazione progettata per il determinato VLP. Rispetto all’ingegneria genetica, coniugazione chimica dei peptidi stranieri a VLP Visualizza un vantaggio significativo perché permette una grande varietà di soggetti, quali peptidi o oligosaccaridi, per essere coniugata con la superficie di VIP in un modulato e modo flessibile senza alterazione dell’Assemblea VLP.
HEVNPs, derivati dalla proteina del capside HEV ricombinante, 2nd aperto lettura telaio (ORF2), sono non-infettiva, auto-assemblanti capsidi capace di cella-associazione e voce. Perché HEV evoluto per la trasmissione della mucosa, la proteina del capside assemblato è allo stesso modo stabile in condizioni mucoso proteolitici e acide5. HEVNPs formare una cavità, T = 1 capside icosaedrica, composto da 60 unità identiche6,7 di ORF2, rendendolo altamente stabile sia in condizioni fisiologiche in deposito. In mancanza di qualsiasi elemento genetico virale, la produzione efficiente, ad alto rendimento si ottiene attraverso il sistema di espressione di baculovirus in cellule di insetto. A causa della loro stabilità proteolitica, HEVNPs auto-assemblati vengono estratti e purificati dal surnatante delle cellule, riducendo notevolmente la procedura di purificazione necessaria. Inoltre, HEVNPs possiedono un superficie esposta protrusione dominio (P) collegato attraverso una cerniera flessibile ad una stabile base icosaedrica. Il dominio P forma picchi di superficie-esposta sopra la base icosahedral mentre la cerniera flessibile rende possibile modificare sensibilmente il dominio P senza compromettere la struttura icosaedrica. Con 60 unità ripetute, singola modifica site-specific si traduce in 60 siti simmetriche per modulazione chimica. Recentemente, abbiamo proposto una nano-piattaforma usando HEVNP che sappia coniugare chimicamente ligandi o piccole molecole per applicazioni teranostici. Questo è stato ottenuto sostituendo un singolo aminoacido con cisteina nel dominio di protrusione di HEV-VLP come un sito di reazione con molecole o peptidi maleimide-collegata. Sulla base di precedenti analisi strutturali di HEV-VLP e ben studiati gli epitopi immunogenici8,9i seguenti cinque di aminoacidi HEV-VLP sono stati sostituiti con cisteina come potenziali candidati: Y485C, T489C, S533C, N573C e T586C ( Figura 1). Dopo espressione e purificazione da cellule di insetto, loro formazioni VLP sono stati confermati tramite l’osservazione di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione (Figura 2), e i siti di cisteina esposta sono stati analizzati mediante Western blot dopo biotina legata al maleimide Coniugazione (Figura 2). Tra i cinque mutanti, HEVNP – 573C visualizzato il segnale più forte di coniugazione maleimide-biotina (Figura 2) ed è stato usato per follow-up dimostrazione come il nanocarrier per cellule di cancro al seno destinazione4 (Figura 3).
Questo protocollo descrive metodi di coniugazione chimica per allegare molecole targeting tumorale HEVNPs attraverso la coniugazione di cisteina superficiale. Dettagliamo la coniugazione di molecole di targeting e di rilevazione del tumore per la consegna del tumore con HEVNPs ricombinante contenente una cisteina a N573 (HEVNP – 573C). Ci siamo concentrati su un processo di coniugazione chimica clic in due passaggi per associare un tumore di cancro del seno targeting peptide, LXY3010 per HEVNPs al modulo LXY30-HEVNP (Figura 4). Successivamente, N-hydroxysuccimide (NHS)-CY 5.5 sono state coniugate al sito Lys separato su HEVNPs per costruire LXY30-HEVNP-CY 5.5 per rilevazione fluorescente sia in vitro (Figura 5) e in vivo4.
Protocol
Representative Results
Discussion
A differenza della procedura di ingegneria genetica che richiede tempo, che prende di solito settimane, Qui dimostriamo in due semplici passaggi e le procedure di coniugazione chimica One-Step, che possono essere completate entro 3 giorni, aggiungendo il cancro ligando di targeting e/o fluorescenza della tintura di rilevamento per i siti di Cys/Lys di HEVNPs. La tecnica può essere utilizzata a schermo per la migliore destinazione di legante da un pool di candidati e quindi sfrutta i servizi di sintesi disponibili peptid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono la sponsorizzazione del finanziamento a RHC di NIH concedere #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Istituto nazionale di cibo e agricoltura, nonché il programma Finlandia Distinguished Professor.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
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