Визуализация актина и микротрубочек Cytoskeletons на B-клетки иммунной синапса, с помощью микроскопии простимулированное излучение истощения (интереса)
Summary
Мы представляем протокол с помощью микроскопии интереса одновременно изображение актина структур, микротрубочки и микротрубочек плюс конец связывания белков в клетках B, которые распространились на coverslips покрытием с антителами к B-клеточный рецептор, модель для начального этапа формирования иммунной синапса.
Abstract
B-клеток, которые связывают мембраны прыгните антигены (например, на поверхности антиген представляющих клеток) образуют иммунной синапса, специализированные клеточную структуру, которая оптимизирует B-клеточной сигнализации рецептора (BCR) и приобретение BCR-опосредованной антигена. Ремоделирование Цитоскелет актина и переориентации микротрубочек сети к антигена контакт сайта имеют важное значение для формирования иммунной синапса. Ремоделирование Цитоскелет актина в плотной периферийное кольцо F-актина сопровождается поляризации микротрубочек Организация центра к иммунной синапсе. Микротрубочки плюс конец связывания белков, а также белки корковых плюс конец захвата посредником физических взаимодействий между актина и микротрубочек cytoskeletons, которые позволяют им быть реорганизована на скоординированной основе. Изучение механизмов управления, которую этот цитоскелета реорганизации, а также понять как эти цитоскелета структуры формы формирования иммунной синапса и BCR сигнализации, может обеспечить новое понимание активации B клеток. Это способствовало разработке суперразрешением микроскопии подходов, которые показывают новые детали цитоскелета сети Организации. Здесь мы описываем метод с помощью микроскопии простимулированное излучение истощения (интереса) одновременно изображение актина структур, микротрубочки и transfected GFP-тегами микротрубочек плюс конец связывания белков в клетках B. Модель раннего события в формировании иммунитета синапса, мы позволяем клетки B распространить на coverslips покрытием с anti-иммуноглобулина (анти Ig) антител, которые инициируют BCR сигнализации и модернизация цитоскелета. Мы предоставляем пошаговые протоколы для выражения GFP синтез белков в клетках A20 B-лимфомы, за распространение анти Ig индуцированной клеток и для фиксации последующие ячейки, иммуноокрашивания, получение изображения и изображения деконволюция шаги. Изображения с высоким разрешением, полученных с помощью этих процедур позволяют одновременно визуализировать актина структуры, микротрубочки и микротрубочек плюс конец связывающих белков, которые могут связать эти две сети цитоскелета.
Introduction
Когда клетки B связать поляризованных массивы антигенов (например, отображаются на поверхности антиген представляя клетки (АПК)), полученный B-клеточный рецептор (BCR) сигнализации диски, формирование структуры классический иммунной синапса, который был впервые описано в T клетки1,2,3,4,5,6,,78,9,10, 11,12,13. Первоначально microclusters формы БКРС антиген прыгните на периферии клетки B: APC связаться с сайта. Эти microclusters затем двигаться в направлении центра антигена контакт сайта, где они сливаются в Центральной супрамолекулярные активации кластер (cSMAC), который образует ядро иммунной синапса. Формирование иммунной синапса оптимизирует BCR сигнализации и облегчает извлечение BCR-опосредованной антигена APC мембраны14. Это приобретение антиген, который следуют интернализации BCR-опосредованной антигена и обработки последующих антигена, позволяет клетки B представить пептида: MHC II комплексов для Т-клетки и вызывают Т-клеток помощь14. Потому что формирование иммунной синапса способствует активации клеток B, определить механизмы, которые устанавливают этот функциональный шаблон Организации рецептор может обеспечить новое понимание как гуморального иммунного ответа инициируются и регулируется.
Реорганизация актина и микротрубочек cytoskeletons имеет важное значение для формирования иммунной синапса. Локализованные BCR сигнализации стимулируется пространственно поляризованных массив антигенов стимулирует быстрое и резкое ремоделирования Цитоскелет актина,1,,15. Формирование структур дендритных актина на периферии клетки B оказывает движущей силы на плазматической мембраны и способствует клетки B распространения. Это позволяет клетки B для сканирования большую площадь поверхности антиген подшипник и увеличивает количество БКРС, которые связывают антигена и активировать BCR, сигнальные пути. В то же время сеть микротрубочек и КТВМ переориентирована на сайт антигена контакта. Как КТВМ подходов контакт сайта антигена, микротрубочки, вытекающих из КТВМ протянулись вдоль внутренней поверхности плазматической мембраны на стыке между клетки B и поверхности антиген подшипника16,17. Затем эти juxtamembrane микротрубочки может выступать в качестве треков для Динеин опосредованной центростремительного движения антиген прыгните BCR microclusters18, приводит к образованию cSMAC.
Переориентация и поляризации КТВМ к иммунной синапса требует нетронутыми актина и микротрубочек cytoskeletons и часто зависит от взаимодействия между корковой актина сети и микротрубочек16,17, 19,20. Корковых актин связывающих белков, таких как IQGAP1, можно захватить микротрубочек, взаимодействуя с белковых комплексов, которые украшают микротрубочек плюс заканчивается21. Эти динамические комплексы плюс конец связывания белков включают в себя EB1 и клип-170, которые обозначаются как микротрубочек плюс конец отслеживания белков (+ советы)21,22. + Подсказки на концах микротрубочек можно привязать к белки, которые связаны с плазматической мембраны или корковые актина цитоскелета. Это позволяет силы создание механизмов (например, минус конец направленного движения cortically якорь Динеин вдоль микротрубочек) оказывают потянув силы на микротрубочек, и тем самым изменить КТВМ. КЛИП-170 можно привязать к актин связанные леса белка IQGAP123, и мы показали, что оба эти белки необходимы для КТВМ BCR-индуцированной поляризации к иммунной синапса17. Это взаимодействие IQGAP1-клип-170 может играть ключевую роль в координации, Ремоделирование Цитоскелет актина с репозиционирования микротрубочек сети на B-клетки иммунной синапса.
Обычных флуоресцентной микроскопии показал резкое реорганизации актина и микротрубочек cytoskeletons во время B-клетки иммунной синапса формирования2. Однако этот подход не может разрешить небольших клеточных структур в деталях из-за дифракционный предел света, который, согласно закону Аббе, зависит от длины волны света, используется для освещения образца и диафрагмы объективных24. Этот дифракционный предел ограничивает разрешение обычного света Микроскопы до 200-300 Нм в боковой направлении и 500-700 Нм в осевом направлении25. Таким образом меньше внутриклеточных структур, а также мелкие детали актина и микротрубочек cytoskeletons, можно только наблюдать с помощью электронной микроскопии. Микроскопии изображений цитоскелета отнимает много времени, требует суровых образца фиксации и подготовка протоколов, которые можно изменять биологических структур и ограничен для обнаружения антител опосредованной. Способность к имунноконтраст и одновременно изображение несколько белков или клеточных структур является существенным преимуществом микроскопии флуоресцирования. Кроме того выражая флуоресцентные синтез белков в клетках позволяет в реальном времени обработки изображений и является полезным, когда эффективные антитела для иммуноокрашивания протеина интереса не доступны.
Последние технологические достижения в микроскопии суперразрешением преодолеть ограничения дифракции света и позволяет визуализировать наноразмерных клеточных структур24. Один из таких методов микроскопии суперразрешением называется микроскопии простимулированное излучение истощения (интереса). СИГНАЛУ использует два лазера, где один лазерный возбуждает Флюорофор и второй лазерный с рисунком форме пончика избирательно подавляет флуоресценции выбросов вокруг Флюорофор. Это уменьшает точки распространения функция (очевидной район) одной флуоресцентные частицы и предоставляет югу дифракционный предел флуоресцентного изображения25,26. Микроскопия истощение земли государство также использует методы, основанные на флуоресценции, приобрести супер-разрешение изображения. Однако долгое время приобретения и реконструкции изображения, есть только ограниченное количество флуорофоров, который может быть использован, и одновременно с высоким разрешением изображения нескольких цитоскелетных компонентов технически сложным, потому что поддержание Актин и микротрубочек структур требует фиксации различных процедур. Таким образом интереса имеет несколько преимуществ над электронной микроскопии и других микроскопии суперразрешением подходы в том, что он предлагает быстрое изображение приобретения, имеет минимальные требования к пост-обработки и использует же флуорофоров и пятная методы которые используются для обычных флуоресцентной микроскопии фиксированной образцы26.
Супер-резолюции микроскопии теперь был использован для визуализации актина структур на иммунные синапсов в естественных убийца клеток (НК) и T клетки26,27,28,,2930, 31. Однако, супер резолюции изображений микротрубочек цитоскелета, а также скоординированных реорганизации актина и микротрубочек cytoskeletons во время формирования иммунной синапса, лишь недавно был сообщил17. Мы использовали интереса микроскопии изображений B клеток, которые было разрешено распространить на coverslips покрытием с антителами anti-иммуноглобулина (анти Ig), которые стимулируют BCR сигнализации и инициировать реорганизацию цитоскелета. Когда покрытием на иммобилизованные антитела анти Ig, B клетки проходят драматические актин-зависит от распространения, который повторяет первоначальных событий во время формирования иммунной синапса. Важно отметить, что интереса микроскопии выявлены мелкие детали дендритных кольцо F-актина, что формы на периферии иммунной синапса и показало, что недалеко от антигена контакт сайта17переехали КТВМ, а также микротрубочек, прилагается к нему. Эти микротрубочек расширенной наружу к периферийное кольцо F-актина. Кроме того, многоцветные изображения интереса различных комбинаций F-актина, тубулин, IQGAP1 и GFP-тегами клип-170 + советы показали, что микротрубочки плюс концы отмечен клип-170-ГФП были тесно связаны с сеть периферийных актина и IQGAP1, корковых захвата белка17.
Здесь мы представляем подробный протокол для визуализации актина и микротрубочек cytoskeletons на иммунные синапса, с помощью микроскопии интереса. Эти методы были оптимизированы с помощью линии A20 мышиных клетки B, который широко использовался для изучения BCR сигнализации и иммунных синапса формирования17,,3233,,3435 , 36 , 37 , 38 , 39. Поскольку коммерческие антител к клип-170 не работает хорошо для иммуноокрашивания в предыдущих экспериментах, мы подробно описать выражение гена GFP-тегами клип-170 в клетках A20, наряду с пятная протоколы одновременно визуализации до три цитоскелетных компонентов или Белки цитоскелета связанные. Методы использования микроскопии интереса к Изображение актина в NK клеток иммунной синапсы были описаны ранее40. Здесь мы передаем это приобретение суперразрешением многоцветные изображения актина и микротрубочек cytoskeletons в клетки.
Критическое рассмотрение для микроскопии суперразрешением использует соответствующий фиксации процедур для поддержания клеточных структур и предотвращения ущерба для флуоресцентных белков. Фиксация и пятная методы, представленные в настоящем документе были оптимизированы для сохранить GFP флуоресценции и обеспечить высоким разрешением изображений сетей актина и микротрубочек. При выражении флуоресцентных белков, следует отметить, что клетки B, обычно трудно transfect. Используя этот протокол, 20-50% A20 клетки обычно выражают transfected синтез белка GFP, и среди этой группы населения уровень экспрессии белков являются переменными. Тем не менее, супер резолюции изображений актина и микротрубочек, с использованием процедур, мы описали довольно надежные и легко получаются изображения высокого качества. Несмотря на их небольшой размер относительно ячейки A20 мы показываем, что эти процедуры могут также использоваться для изображений в сети микротрубочек в первичных B-клетки, которые были кратко активированы с липополисахарида (LPS). Мы показали, что LPS-активированный первичной клетки B может transfected с малые интерферирующие РНК в относительно высокой эффективности (т.е., такие что истощение белка может быть обнаружен, immunoblotting), что делает их хорошей альтернативой для использования линий клетки B для некоторых исследований 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подробные изображения цитоскелета структур могут быть получены с помощью микроскопии суперразрешением интереса, который теоретически может достичь урегулирования 50 Нм, по сравнению с обычными confocal микроскопии, для которого дифракционный резолюции составляет ~ 200 Нм 24. сп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим визуализации объекта UBC института наук о жизни (LSI) за поддержание интереса микроскопа. Эта работа финансировалась Грант #68865 от канадской институтов медицинских исследований (M.R.G.). Мы благодарим д-р Козо Kaibuchi (Университет Нагоя, Нагоя, Япония) за клип-170-GFP плазмиды.
Materials
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. . The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
