In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen
Summary
Zwei Methoden werden hier vorgestellt, um intestinale Barrierefunktion zu bestimmen. Eine epitheliale Meter (Volt/Ohm) dient zur Messung des elektrischen Widerstands berührt der kultivierten Epithelien direkt in Gewebekultur Brunnen. Bei Mäusen ist die FITC-Dextran-Magensonde-Methode zur Ermittlung der intestinalen Permeabilität in Vivo.
Abstract
Die Darmbarriere schützt vor pathogenen Mikroorganismus und mikrobielle Toxin. Seine Funktion unterliegt engen Kreuzung Durchlässigkeit und Epithelzelle Integrität, und Störungen der intestinalen Barrierefunktion trägt zur Weiterentwicklung des Magen-Darm- und systemische Erkrankung. Zwei einfache Methoden werden hier beschrieben, um die Durchlässigkeit des Darmepithels zu messen. In Vitro, Caco-2BBe Zellen sind in Gewebekultur Brunnen als einem monomolekularen Film beschichtet und ttransepitelialen elektrischen Widerstand (TER) kann von einem epithelialen (Volt /) Ohmmeter gemessen werden. Diese Methode überzeugt durch seine einfache Bedienung und Wiederholbarkeit. In-vivo -Mäuse sind gavaged mit 4 kDa Fluorescein erfolgt (FITC)-Dextran und die FITC-Dextran-Konzentrationen werden in gesammelten Serumproben von Mäusen zu bestimmen, die epitheliale Durchlässigkeit gemessen. Orale Magensonde bietet eine genaue Dosierung, und daher die bevorzugte Methode zur Messung der intestinalen Permeabilität in Vivo. Zusammen genommen, diese beiden Methoden können die Durchlässigkeit des Darmepithels in Vitro und in Vivozu messen und daher verwendet werden, um die Verbindung zwischen Krankheiten und Barrierefunktion zu studieren.
Introduction
Intestinale Epithelzellen sind nicht nur verantwortlich für die Absorption von Nährstoffen, sondern auch eine wichtige Barriere zur Abwehr von pathogenen Mikroorganismen und mikrobielle Toxine bilden. Diese Funktion der Darmbarriere unterliegt engen Kreuzung Durchlässigkeit und Epithelzelle Integrität1,2,3, und Dysfunktion der epitheliale Barrierefunktion ist verbunden mit entzündlichen Darmerkrankungen Krankheit (IBD). Perijunctional Actomyosin Ring (PAMR) liegt innerhalb der Zelle, die auf die tight Junctions eng zusammenhängend ist. Die Kontraktion der PAMR, die durch die Myosin-Leichtketten (MLC) geregelt wird, ist entscheidend für die Regulierung der engen Kreuzung Durchlässigkeit4,5,6,7,8, 9,10. Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist zentral für die Darmbarriere Verlust durch heraufregulierende intestinale epitheliale MLC-Kinase (MLCK) Ausdruck und induzieren occludin Internalisierung11,12,13.
Ionen wie Na+ und Cl– können parazellulär Raum durchqueren, durch die Pore oder Leck Weg14. In einem “undichten” Epithel Änderungen in TER in erster Linie veränderte engen Kreuzung Durchlässigkeit. TER-Messung ist ein häufig verwendete elektrophysiologische Ansatz, engen Kreuzung Durchlässigkeit, in erster Linie für Na+ und Cl–, basierend auf die Impedanz der Zelle Monolagen zu quantifizieren. Verschiedene Zelltypen, einschließlich intestinale Epithelzellen, pulmonaler Epithelzellen und vaskulären endothelialen Zellen wurden für TER Messungen berichtet. Vorteile dieser Methode sind, dass TER Messungen nicht-invasiv sind und verwendet werden, können um lebende Zellen in Echtzeit zu überwachen. Darüber hinaus eignet sich die TER-Messtechnik für Drogen Toxizität Studien15.
Caco-2BBe menschlichen epithelialen kolorektalen Adenokarzinom Zellen mit einer Struktur und Funktion ähnlich wie die differenzierte kleinen intestinalen Epithelzellen sind: zum Beispiel haben diese Zellen Mikrovilli und Enzyme, die verbunden sind mit kleinen Darm Pinsel Grenze. Daher sind kultivierte Caco-2BBe Monolagen als in-vitro- Modell Barrierefunktion zu Testzwecken genutzt.
Bei Mäusen ist Einweg, intestinale parazellulär Durchlässigkeit zu studieren durch die Messung der Fähigkeit der FITC-Dextran aus dem Lumen ins Blut zu überqueren. Somit kann die intestinale Permeabilität von Gavaging FITC-Dextran direkt in Mäusen und Messung der Fluoreszenz im Blut beurteilt werden. Das folgende Protokoll beschreibt zwei einfache Methoden zur Beurteilung des Darmepithels Durchlässigkeit in Vitro und in Vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Caco-2BBe (die Grenze des Pinsel-Ausdruck) Zellen sind immer für TER Messung, ausgewählt von der Caco-2-Zell-Linie für Pinsel-Grenze Proteinexpression verwendet. Caco-2BBe Zellen haben einen Villus absorptive Phänotyp bei differenziert (nach ca. 3 Wochen nach dem Zusammenfluss Kultur)17. Es ist notwendig zur Vermeidung von Kontaminationen während der Messung und die Elektrode zu sterilisieren. Da das Verfahren nicht steril ist, können die Messu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Jerrold R. Turner vom Brigham and Women es Hospital, Harvard Medical School, für seine großzügige Unterstützung bei der Durchführung dieser Studie. Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation von China (Grant-Nummer 81470804, 31401229 und 81200620), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (Grant-Nummer BK20180838 und BK20140319), The Innovation Forschungsprogramm für College Absolventen der Provinz Jiangsu (Grant-Nummer KYLX16-0116), Advanced Research Projekte der Soochow University (Grant-Nummer SDY2015_06), Morbus Crohn und Colitis Foundation Research Fellowship Award (Gewährungsnummer 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
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