התפשטות ובידול של קודמן מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R תאים
Summary
כאן מוצגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים culturing הקו תא 32D/G-CSF-R מאתר קודמן מיאלואידית, ביצוע זיהומים נגיפיים של ביצוע מבחני התפשטות ובידול. הקו תא מתאים ללמוד פיתוח התאים מיאלואידית, ואת התפקיד של גנים של עניין גדילת התאים מיאלואידית ובידול neutrophilic.
Abstract
ההבנה של הביולוגיה תא גזע, קדמון hematopoietic יש השלכות חשובות על רפואה רגנרטיבית והטיפול של פתולוגיות hematological. למרות הנתונים הרלוונטיים ביותר שניתן לרכשה באמצעות מודלים ויוו או תרבויות העיקרי, שפע נמוכה של תאי גזע וקדמון hematopoietic מגבילה במידה ניכרת את הבריכה של טכניקות מתאימים עבור החקירה שלהם. לכן, השימוש של שורות תאים מאפשרת ייצור מספיק של חומר ביולוגי עבור הביצועים של הקרנות או מבחני הדורשות תאים גדולים מספרים. כאן אנו מציגים תיאור מפורט, בדיקה, פרשנות של מבחני התפשטות ובידול אשר משמשים לחקירה של תהליכים מעורבים myelopoiesis ובידול neutrophilic. ניסויים אלה מעסיקים הקו מהתא מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R ציטוקינים, אשר ברשותה את היכולת להתרבות בנוכחות IL-3, להבדיל ב- G-CSF. אנו מספקים מותאם פרוטוקולים לטיפול 32D/G-CSF-R תאים, לדבר על החסרונות העיקריים והחסרונות שיכול לסכן את מבחני שתואר ואת התוצאות הצפויות. בנוסף, מאמר זה מכיל פרוטוקולים עבור ייצור lentiviral, retroviral טיטור, התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R. נדגים כי מניפולציה גנטית של תאים אלה יכול להיות מועסק כדי לבצע בהצלחה לימודי פונקציונלי ומולקולרית, אשר יוכלו להשלים את התוצאות המתקבלות עם ראשי hematopoietic תאי גזע וקדמון או מודלים ויוו .
Introduction
האוכלוסייה גזע ו קדמון hematopoietic מספקת האורגניזם עם מגוון גדול של תאים בוגרים, כולל תאים מן השושלת מיאלואידית (נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים, ו ומונוציטים). תהליך שמניע את הייצור של התאים מיאלואידית מתאי גזע hematopoietic ידוע בשם myelopoiesis, ייצור מספיק של התאים מיאלואידית בוגרים בתגובה לדרישות השוק המשתנות הוא תנאי הכרחי להתמודדות נכונה של האורגניזם עם הלחץ תנאים, כגון זיהומים ואובדן דם. ההפקה מספקת של התאים מיאלואידית בוגרים עלול להוביל לחוסר יכולת לחסל פתוגנים, קרישת דם מופחתת, ו אחרים סכנת חיים בתנאים1,2. בנוסף, שינויים בהתפתחות השושלת מיאלואידית עשוי גם להיות מזוהה עם hematological ממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)3. שינויים myelopoiesis עלולה להתרחש מסיבות שונות, כגון פגמים משטח קולטני התא4, ביטויים מסולף של גורמי שעתוק5, ליקויי איתות המסלולים6, מוטציות וכתוצאה מכך היווצרות / הפעלה של oncogenes7או איון של הגידול משתיק קול גנים8.
פותחו שיטות שונות ללמוד פיתוח מיאלואידית, ואף להעריך את ההשפעה של שינויים גנטיים מסוימים בתהליך זה. גישות נפוצות המשמשות ללימוד myelopoiesis לערב ראשי התאים ואת העכברים הטרנסגניים. על פי מודלים אלה לאפשר רכישת נתונים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, יש להם מגבלות מסוימות. השימוש העיקרי תאים מפגשים מספר מצומצם של תאים, תקופה מוגבלת של תרבות, צמצום האפשרויות לשינוי גנים וניתוח ביולוגי או ביוכימי עוקבות. העכברים הטרנסגניים יקרות ודורשים מידה סבירה של הצדקה ביולוגית. בנוסף, עבודה עם מודלים ויוו מוסיף דרגת המורכבות לתוך להבין את התפקיד של הגן עניין בתהליך נתונה. לכן, גישות אלטרנטיביות כדי לעקוף את מגבלות אלה נדרשים. שורות תאים יש יתרונות עוררין: (1) שהם בעלי יכולת התפשטות ללא הגבלה המאפשרת יצירת מספיק חומר עבור מחקרים ביוכימיים וביולוגיים, (2) הם רגישים מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט, ביטוי), (3) העלות היא נמוכה יחסית, (4) הם לאפשר מידה מסוימת של הפשטה ביולוגי הנדרשים גישות ניסיוניות מסוימים.
הורים IL-3 (אינטרלוקין-3) 32D תלויה שורת התאים הוקמה בשנת 1983 על ידי Greenberger ועמיתיו על-ידי זיהום של תאים במח העצם של עכברים C3H/HeJ עם החבר לוקמיה מאתר וירוס9. מספר שיבוטים 32D תוארו בספרות: cl-239, cl-310ו- cl-1011. התאים cl-3 32D הוצגו כדי להתרבות IL-3 עוברים התמיינות neutrophilic על טיפול עם מושבת גרנולוציט גירוי פקטור (G-CSF)10. להיפך, 32D cl-10 תאים, תוך כדי להיות איל-3 תלוי במקור היו לא המבדילים בתגובה לטיפול G-CSF. בשנת 1995 הקבוצה של ד ר איבו Touw transduced retrovirally 32D cl-10 תאים עם פראי סוג וצורות מוטציה של קולטן G-CSF (G-CSF-R), על מנת לזהות אזורים חשיבות תפקודית של קולטן זה11. מחקר זה הניב בדור של התאים 32D/G-CSF-R, אשר תלויות באופן דומה ב- IL-3, אבל בתוך 6 עד 10 ימים לאחר החלפה של IL-3 עם G-CSF, תאים להפסיק להתרבות, בלתי הפיך להתמיין נויטרופילים בוגרת. מאפיינים אלה להפוך 32D cl-3 תאים 32D/G-CSF-R מודלים מפושטת של התמיינות neutrophilic מאתר זה יכול להיות מווסת על ידי שני גורמים בידול – IL-3 ו- G-CSF וצמיחה מוגדרים היטב. בעשורים האחרונים קבוצות מרובות השתמשו 32D/G-CSF-R תאים ללמוד את התפקיד של גנים מסוימים התפשטות ו התמיינות של התאים מיאלואידית תרבות12,13,14,15 , 16, ללמוד G-CSF איתות17,18. חשוב לציין, התוצאות המתקבלות באמצעות הקו תא בקורלציה עם נתונים שהושגו עם ראשי תאים, העכברים הטרנסגניים16,19,20,21. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי תאים 32D/G-CSF-R, להיות דוגמנית בשימוש נרחב ומבוסס היטב, מייצגים מערכת יקר ללמוד התמיינות תאים מיאלואידים אשר יכול לשמש במקביל עם גישות אחרות מיעון השאלה הזאת.
. הנה, פרוטוקולים מפורט המתאר טיפול של הקו תא 32D/G-CSF-R, איזה כיסוי הרחבה בידול, הערכה של התפשטות, התמיינות של תאים אלה מוצג. מידע מפורט על ההנדסה הגנטית של תאים 32D/G-CSF-R, או על ידי התמרה חושית retroviral או lentiviral, וכן פרוטוקולים עבור טיטור וירוס הינם מסופקים. בנוסף, ניתנים מספר תוצאות נציג המדגימים יישומים אפשריים של תאים 32D/G-CSF-R.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבחירה של מדגם ניסיוני הוא אחד הנושאים המרכזיים במחקר. למרות ראשי תאים בעלי חיים ועל האדם הם האמינו כדי לייצר את הנתונים הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית, מודלים אלה עשויה להיות כרוכה חששות אתיים, הקשורים לעתים קרובות עם יקרים ו/או מתוחכם בידוד/culturing הליכים. ראשי תאים מוגבלים במספרים, קשה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה פרופסור ruud ב Delwel פרופסור איבו Touw שסיפקו שורת התאים 32D/G-CSF-R, ואת פרופסור דניאל ג Tenen סיפק לנו שורת התאים Bosc23. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הסוכנות מענק של הרפובליקה הצ’כית (GACR 15-03796S ו- GACR 17-02177S) כדי MA-J, תמיכה מן המכון לגנטיקה מולקולרית האקדמיה למדעים של הצ’כית (RVO 68378050) MA-J, מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 341015) מ אוניברסיטת קארל בפראג ח”כ ולאחר מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 1278217) מ אוניברסיטת קארל בפראג לתחנת משטרה.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
References
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
- Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
- Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
- Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
- Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
- Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
- Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
- Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
- Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
- Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
- Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
- Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
- Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
- Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
- Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
- Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
- Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
- Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
- Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
- Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
- Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
- Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
- Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
- Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
- Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
- Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
- Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
- Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
- Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
- Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
- Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
- Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
- Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
- Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
- Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
- Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
- Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
- Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).
