प्रसार और Murine माइलॉयड अग्रदूत 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के भेदभाव
Summary
यहां संवर्धन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल murine माइलॉयड अग्रदूत 32D/जी-सीएसएफ-R सेल लाइन, वायरल संक्रमण प्रदर्शन, और बाहर ले जाने के प्रसार और विभेद परख प्रस्तुत कर रहे हैं । यह सेल लाइन माइलॉयड कोशिका विकास की पढ़ाई के लिए उपयुक्त है, और माइलॉयड सेल विकास और neutrophilic भेदभाव में रुचि के जीन की भूमिका ।
Abstract
टेम स्टेम और जनक कोशिका जीवविज्ञान की समझ अपक्षयी दवा और रक्त विकृतियों के उपचार के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है । सबसे अधिक प्रासंगिक डेटा है कि vivo मॉडल या प्राथमिक संस्कृतियों में का उपयोग कर अधिग्रहीत किया जा सकता है के बावजूद, टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं की कम बहुतायत काफी उनकी जांच के लिए उपयुक्त तकनीकों के पूल प्रतिबंधित । इसलिए, सेल लाइनों के उपयोग की अनुमति देता है कि बड़े सेल की संख्या की आवश्यकता होती है या स्क्रीन के प्रदर्शन के लिए जैविक सामग्री का पर्याप्त उत्पादन । यहां हम एक विस्तृत वर्णन, readout, और प्रसार और भेदभाव परख जो myelopoiesis और neutrophilic भेदभाव में शामिल प्रक्रियाओं की जांच के लिए उपयोग किया जाता है की व्याख्या प्रस्तुत करते हैं । इन प्रयोगों 32D/जी-सीएसएफ-R cytokine निर्भर murine माइलॉयड सेल लाइन है, जो IL-3 की उपस्थिति में पैदा करना और जी सीएसएफ में अंतर करने की क्षमता के पास रोजगार । हम 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं से निपटने और प्रमुख नुकसान और कमियां है कि वर्णित परख और अपेक्षित परिणाम समझौता हो सकता है पर चर्चा के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । साथ ही, इस आलेख में lentiviral और retroviral उत्पादन, अनुमापन, और transduction के 32D/G-सीएसएफ-R कक्षों के लिए प्रोटोकॉल हैं । हम प्रदर्शित करते है कि इन कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर को सफलतापूर्वक कार्यात्मक और आणविक अध्ययन, जो प्राथमिक टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं या vivo में मॉडलों के साथ प्राप्त परिणामों के पूरक कर सकते है प्रदर्शन कार्यरत किया जा सकता है ।
Introduction
टेम स्टेम और जनक आबादी परिपक्व कोशिकाओं की एक बड़ी रेंज के साथ जीव की आपूर्ति, माइलॉयड वंश से कोशिकाओं को शामिल (न्यूट्रोफिल, इयोस्नोफिल्स, बेसोफिल, और monocytes) । प्रक्रिया है कि टेम स्टेम कोशिकाओं से माइलॉयड कोशिकाओं के उत्पादन ड्राइव myelopoiesis के रूप में जाना जाता है, और बदलने की मांग के जवाब में परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं का पर्याप्त उत्पादन तनाव के साथ जीव का उचित मुकाबला करने के लिए एक शर्त है शर्तों, जैसे संक्रमण और खून की कमी । परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं की अपर्याप्त उत्पादन रोगजनकों, कम रक्त जमावट, और अन्य जीवन की धमकी शर्तों1,2को खत्म करने के लिए अक्षमता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, माइलॉयड वंश विकास में परिवर्तन भी ऐसी गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) के रूप में रक्त द्रोह, के साथ जुड़ा हो सकता है3. myelopoiesis में परिवर्तन विभिन्न कारणों से हो सकता है, जैसे कोशिका की सतह रिसेप्टर्स में दोष के रूप में4, प्रतिलेखन कारकों की बदल अभिव्यक्ति5, बिगड़ा संकेत रास्ते6, परिवर्तन गठन में जिसके परिणामस्वरूप/ oncogenes7, या ट्यूमर शमन करनेवाला जीन की निष्क्रियता के सक्रियकरण8।
विभिंन तरीकों माइलॉयड विकास का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, और इस प्रक्रिया में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव का आकलन । myelopoiesis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया आम दृष्टिकोण प्राथमिक कोशिकाओं और ट्रांसजेनिक चूहों शामिल. हालांकि इन मॉडलों को जैविक रूप से प्रासंगिक डेटा के अधिग्रहण की अनुमति है, वे कुछ सीमाएं हैं । प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं की एक सीमित संख्या और संस्कृति की एक प्रतिबंधित अवधि मुठभेड़ों, जीन अभिव्यक्ति और बाद में जैविक या जैव रासायनिक विश्लेषण को बदलने के लिए संभावनाओं को सीमित. ट्रांसजेनिक चूहों महंगा है और जैविक औचित्य की एक उचित डिग्री की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, vivo में मॉडल के साथ काम करना एक दिया प्रक्रिया में ब्याज की एक जीन की भूमिका को समझने में जटिलता की एक डिग्री कहते हैं । इसलिए, इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण की जरूरत है । सेल लाइनों निर्विवाद लाभ है: (1) वे जैव रासायनिक और जैविक अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री पैदा करने की अनुमति देता है कि असीमित प्रसार क्षमता के अधिकारी, (2) वे आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं (पछाड़ना, नॉकआउट, एक्सप्रेस), (3) लागत अपेक्षाकृत कम है, और (4) वे कुछ प्रायोगिक दृष्टिकोण में आवश्यक जैविक सरलीकरण की एक डिग्री की अनुमति ।
पैतृक आईएल 3 (Interleukin-3) निर्भर 32D सेल लाइन १९८३ में Greenberger और सहयोगियों द्वारा C3H/HeJ चूहों से अस्थि मज्जा कोशिकाओं के संक्रमण के द्वारा स्थापित किया गया था दोस्त murine ल्यूकेमिया वायरस9के साथ । साहित्य में कई 32D क्लोन बताए गए: सीएल-239, सीएल-310, और सीएल-1011। 32D सीएल-3 कोशिकाओं IL-3 में पैदा करना करने के लिए दिखाया गया था और granulocyte-कॉलोनी उत्तेजना कारक (जी सीएसएफ) के साथ उपचार पर neutrophilic भेदभाव से गुजरना 10. इसके विपरीत, 32D सीएल-10 कोशिकाओं, जबकि आईएल 3 पर निर्भर किया जा रहा है, मूल रूप से जी सीएसएफ उपचार के जवाब में अंतर नहीं थे । १९९५ में डॉ इवो Touw retrovirally transduced 32D सीएल के समूह जंगली प्रकार और जी सीएसएफ रिसेप्टर (जी सीएसएफ-आर) के उत्परिवर्ती रूपों के साथ 10 कोशिकाओं, क्रम में इस रिसेप्टर11के कार्यात्मक महत्वपूर्ण क्षेत्रों की पहचान करने के लिए. इस अध्ययन 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं है, जो इसी तरह il-3 पर निर्भर हैं की पीढ़ी के परिणामस्वरूप, लेकिन 6 से 10 दिनों के भीतर il-3 जी के साथ प्रतिस्थापन के बाद सीएसएफ, कोशिकाओं पैदा करना और अचल के लिए बंद करो परिपक्व न्यूट्रोफिल में अंतर. IL-3 और जी-सीएसएफ-इन गुणों 32D सीएल-3 और 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं murine neutrophilic भेदभाव है कि दो अच्छी तरह से परिभाषित विकास और विभेद कारकों द्वारा संग्राहक किया जा सकता के मॉडल सरलीकृत । पिछले दशकों के दौरान कई समूहों 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं का उपयोग किया है प्रसार और संस्कृति में माइलॉयड कोशिकाओं के भेदभाव में विशेष जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए12,13,14,15 , 16, और जी सीएसएफ का अध्ययन17,18संकेतन । महत्वपूर्ण बात, परिणाम प्राथमिक कोशिकाओं और ट्रांसजेनिक चूहों के साथ प्राप्त डेटा के साथ संबंधित इस सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त16,19,20,21. नतीजतन, हमें विश्वास है कि 32D/जी सीएसएफ-आर कोशिकाओं, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है और अच्छी तरह से मॉडल की स्थापना की, माइलॉयड भेदभाव जो अंय इस सवाल को संबोधित दृष्टिकोण के साथ समानांतर में इस्तेमाल किया जा सकता अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
यहां, विस्तृत 32D/G-सीएसएफ-R सेल लाइन है, जो विस्तार, भेदभाव, और प्रसार और इन कोशिकाओं के भेदभाव के आकलन को कवर की हैंडलिंग का वर्णन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन के लिए विस्तृत जानकारी, या तो retroviral या lentiviral transduction द्वारा, साथ ही वायरस अनुमापन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान की जाती हैं । इसके अलावा, 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के संभावित अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करने वाले कई प्रतिनिधि परिणाम प्रदान किए गए हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक प्रयोगात्मक मॉडल का चुनाव अनुसंधान में मुख्य मुद्दों में से एक है । हालांकि प्राथमिक पशु और मानव कोशिकाओं के लिए सबसे अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक डेटा का उत्पादन माना जाता है, इन मॉडलों नैतिक चिंता?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक हमें 32D/जी सीएसएफ-आर सेल लाइन के साथ प्रदान करने के लिए प्रो रुड Delwel और प्रो इवो Touw धंयवाद, और प्रो डैनियल जी तेणें हमें Bosc23 सेल लाइन के साथ प्रदान करने के लिए । यह काम चेक गणराज्य की अनुदान एजेंसी (GACR 15-03796S और GACR 17-02177S) को मा-J के अनुदान से समर्थित था, चेक विज्ञान के आण्विक आनुवंशिकी के संस्थान से सहायता (RVO ६८३७८०५०) एमए-जंमू, एक GA ब्रिटेन फैलोशिप (परियोजना सं ३४१०१५) चार्ल्स विश्वविद्यालय प्राग में एमके के लिए, और एक GA ब्रिटेन फैलोशिप (परियोजना No. १२७८२१७) से चार्ल्स विश्वविद्यालय के प्राग में पीडी के लिए ।
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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