Spredning og differensiering av Murine myelogen forløper 32D/G-CSF-R celler
Summary
Her presenteres detaljert protokoller for dyrking murine myelogen forløper 32D/G-CSF-R celle linjen utfører virusinfeksjoner og gjennomføre spredning og differensiering analyser. Denne cellen linjen er egnet for å studere myelogen celle utvikling og rollen av gener av interesse myelogen cellevekst og neutrophilic differensiering.
Abstract
Forståelse av blodkreft stilk og stamfar cellebiologi har viktige implikasjoner for regenerativ medisin og behandling av Hematologisk patologi. Til tross for de mest relevante dataene som kan erverves i vivo modeller eller primære kulturer, begrenser lav overflod av blodkreft stilk og stamfar celler vesentlig utvalget av egnet teknikker for etterforskningen. Bruken av linjer kan derfor tilstrekkelig produksjon av biologisk materiale til visninger eller analyser som krever stor cellen tallene. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse, avlesning og tolkning av spredning og differensiering analyser som brukes for etterforskningen av prosesser i myelopoiesis og neutrophilic differensiering. Disse eksperimentene ansette 32D/G-CSF-R cytokin underordnet murine myelogen celle linjen, som besitter evnen til å spre seg i nærvær av IL-3 og differensiere i G-CSF. Vi tilbyr optimalisert protokoller for håndtering 32D/G-CSF-R celler og diskutere store fallgruver og ulemper som kan kompromittere beskrevet analyser og forventede resultater. I tillegg inneholder denne artikkelen protokoller for lentiviral og retroviral titrering og signaltransduksjon 32D/G-CSF-R celler. Vi viser at genetisk manipulasjon av disse cellene kan brukes til å utføre funksjonelle og molekylære studier som kan utfylle resultatene med primære blodkreft stilk og stamfar celler eller i vivo modeller.
Introduction
Blodkreft stilk og stamfar befolkningen leverer organisme med et stort utvalg av modne cellene, inkludert celler fra myelogen linjen (nøytrofile, eosinofile, basofile og monocytter). Prosessen som kjører produksjon av myeloide celler fra blodkreft stamceller er kjent som myelopoiesis, og tilstrekkelig produksjon av modne myeloide celler i svar på endrede krav er en forutsetning for riktig mestring av organismen stress forhold, for eksempel infeksjoner og blodtap. Utilstrekkelig produksjon av modne myeloide celler kan føre til manglende evne til å eliminere patogener, redusert blodpropp og andre livstruende forhold1,2. I tillegg kan endringer i myelogen avstamning utvikling også være knyttet til Hematologisk malignitet, som akutt myelogen leukemi (AML)3. Endringer i myelopoiesis kan skyldes ulike årsaker som mangler i cellen overflate reseptorer4, endret uttrykk for transkripsjon faktorer5, svekket signalnettverk trasé6, mutasjoner som resulterer i dannelsen / aktivering av oncogenes7eller inaktivering av tumor suppressor gener8.
Ulike metoder har blitt utviklet for å studere myelogen utvikling og vurdere effekten av konkrete genetiske endringer i denne prosessen. Felles tilnærminger brukt for å studere myelopoiesis innebære primære celler og transgene mus. Selv om disse modellene at oppkjøpet av biologisk relevante data, har de visse begrensninger. Bruk av primære celler møter et begrenset antall celler og en begrenset periode av kultur, begrense mulighetene for å endre genuttrykk og påfølgende biologiske eller biokjemiske analyse. Transgene mus er kostbare og krever en rimelig grad av biologisk begrunnelse. I tillegg gir arbeider med i vivo modeller en grad av kompleksitet til forståelsen av en genet av interesse i en gitt prosess. Derfor er alternative tilnærminger til å omgå disse begrensningene nødvendig. Linjer har udiskutable fordeler: (1) de har ubegrenset spredning kapasitet som gir genererer nok materiale for biokjemisk og biologiske studier, (2) de er utsatt for genetisk manipulasjon (knockdown, knockout, overuttrykte), (3) er relativt lav, og (4) de tillate en grad av biologiske forenkling kreves i visse eksperimentelle tilnærminger.
Den foreldre IL-3 (Interleukin-3) avhengige 32D celle linje ble etablert i 1983 av Greenberger og kolleger av infeksjon beinmargen celleområde fra C3H/HeJ mus med venn murine leukemi virus9. Flere 32D kloner ble beskrevet i litteraturen: cl-239, cl-310og cl-1011. 32D cl-3 cellene ble vist å spre seg i IL-3 og gjennomgå neutrophilic differensiering på behandling med granulocytt-colony stimulering faktor (G-CSF)10. Tvert imot, var 32D cl-10 celler, samtidig som IL-3 avhengige, opprinnelig ikke skille svar på G-CSF behandling. I 1995 transduced gruppen av Dr. Ivo Touw retrovirally 32D cl-10 celler med wild type og mutant former for G-CSF reseptor (G-CSF-R), for å identifisere funksjonelt viktige regioner i denne reseptoren11. Denne studien resulterte i generasjon av 32D/G-CSF-R celler som er tilsvarende avhengige IL-3, men innen 6 til 10 dager etter utskifting av IL-3 med G-CSF, celler slutte å spre og differensiere irreversibelt til modne nøytrofile. Disse egenskapene gjør 32D cl-3 og 32D/G-CSF-R celler forenklet modeller av murine neutrophilic differensiering som kan være modulert av to veldefinerte vekst og differensiering faktorer – IL-3 og G-CSF. I løpet av de siste tiårene har flere grupper brukt 32D/G-CSF-R celler for å studere rollen til bestemte gener i spredning og differensiering av myeloide celler i kultur12,13,14,15 , 16, og å studere G-CSF signalnettverk17,18. Viktigst, resultatene som oppnås ved å bruke denne cellen: korrelert med data innhentet primære celler og transgene mus16,19,20,21. Derfor tror vi at 32D/G-CSF-R celler, blir mye brukt og veletablerte modell, representerer en verdifull system å studere myelogen differensiering som kan brukes parallelt med andre tilnærminger adressering denne spørsmål.
Her, detaljert protokoller som beskriver håndtering av 32D/G-CSF-R cellen linje, som dekker ekspansjon differensiering og vurdering av spredning og differensiering av disse cellene er presentert. Detaljert informasjon for genetisk modifisering av 32D/G-CSF-R celler, enten ved retroviral eller lentiviral signaltransduksjon, samt protokoller for virus titrering er gitt. I tillegg tilbys flere representant resultater som viser potensielle anvendelser av 32D/G-CSF-R celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Valg av en eksperimentell modell er en av de viktigste spørsmålene i forskning. Om primære dyr og menneskelige celler antas å produsere biologisk relevante data, disse modellene kan innebære Etiske bekymringene og er ofte forbundet med dyr og/eller sofistikert isolasjon/dyrking prosedyrer. Primær celler er begrenset i antall og det er vanskelig å genetisk manipulere dem. I tillegg representerer primære cellene en heterogen befolkning består av ulike celletyper som kan komplisere data tolkning29…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Prof Ruud Delwel og Prof Ivo Touw for å gi oss med 32D/G-CSF-R cellen linje og Prof Daniel G. Tenen for å gi oss med Bosc23 cellen linje. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd av Grant byrået i Tsjekkia (GACR 15-03796S og GACR 17-02177S) til MA-J, støtte fra Institutt for molekylær genetikk av tsjekkiske Academy of Sciences (RVO 68378050) til MA-J, et GA UK fellesskap (prosjekt nr. 341015) fra Charles University i Praha MK, og et GA UK fellesskap (prosjekt nr. 1278217) fra Charles University i Praha til PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
References
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
- Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
- Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
- Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
- Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
- Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
- Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
- Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
- Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
- Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
- Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
- Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
- Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
- Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
- Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
- Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
- Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
- Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
- Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
- Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
- Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
- Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
- Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
- Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
- Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
- Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
- Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
- Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
- Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
- Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
- Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
- Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
- Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
- Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
- Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
- Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
- Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
- Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).
