一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

摘要

本文介绍了一种利用腹腔注射荧光示踪剂并结合灌注技术的小鼠脑血管通透性检测方法，适用于血脑屏障功能障碍的动物模型。一侧半脑用于通透性的定量评估，另一侧用于示踪剂的可视化或免疫染色。该实验流程可在10只小鼠中于5至6小时内完成。

摘要

血脑屏障（BBB）是一种特化的屏障，可保护脑微环境免受循环中毒素和病原体的侵害，并维持脑内稳态。该屏障的主要结构基础是脑毛细血管的内皮细胞，其屏障功能源于细胞间紧密连接以及细胞膜上表达的外排转运蛋白。这一功能由周细胞和星形胶质细胞共同调控，它们与内皮细胞一起构成神经血管单元（NVU）。多种神经系统疾病，如脑卒中、阿尔茨海默病（AD）和脑肿瘤，均与血脑屏障功能受损相关。因此，评估血脑屏障通透性对于判断神经系统疾病的严重程度以及所采用治疗策略的效果至关重要。

本文介绍一种简单且稳健的通透性检测方法，该方法已成功应用于多种遗传性和实验性小鼠模型。与常用的显微镜荧光示踪分析相比，本方法具有高度的定量性和客观性。具体方法为：向小鼠腹腔注射混合的水溶性惰性荧光示踪剂，随后将小鼠麻醉。在采集脑、肾或其他器官之前，对动物进行心脏灌注。采集的器官经匀浆、离心处理后，测定上清液中的荧光强度。在灌注前通过心脏穿刺采集的血液用于对血管腔室进行归一化校正。通过将组织荧光信号归一化至组织湿重，并将血清荧光信号进行相应处理，从而获得定量的示踪剂通透性指数。为进一步验证结果，可利用对侧半脑组织（保存用于免疫组织化学）进行示踪剂荧光的可视化观察。

引言

血脑屏障（BBB）由微血管内皮细胞（ECs）构成，这些细胞由紧密相关的周细胞（PCs）支持，并被基底膜包裹，星形胶质细胞（ACs）则以其终足包绕基底膜^1,2。ECs 与多种支持和调节屏障功能的细胞相互作用，主要是 ACs 和 PCs，同时也包括神经元和小胶质细胞，这些细胞共同构成了神经血管单元（NVU）。NVU 对 BBB 的功能至关重要，它限制了血液中的毒素和病原体进入脑组织。这一功能主要依赖于 ECs 之间存在的紧密连接分子，如 claudin-5、occludin 和 zonula occludens-1，以及外排转运蛋白（如 P-糖蛋白，P-gp）的作用，后者可将进入内皮细胞的分子重新泵回血管腔^1,2,3。然而，BBB 也允许葡萄糖、铁、氨基酸等必需营养物质通过 EC 质膜上表达的特异性转运体进行转运^1,2,3。EC 层在腔面（朝向血液）和基底外侧膜（朝向脑组织）之间各种转运体的分布具有高度极性，从而实现特异性和定向的物质转运功能

方案

所有动物均在操作过程中得到精心照料，以最大限度减少疼痛或不适。本操作遵循本机构的动物护理指南，并已获得当地委员会批准（达姆施塔特政府委员会，批准号：FK/1044）。

工作步骤示意图 体内 小鼠通透性检测如图所示 图1各步骤的详细信息如下所述。

1. 动物操作

1. 示踪剂和麻醉剂的准备与给药
   1. 在通透性检测前至少一天准备好用于组织包埋的标记管和模具。整个实验过程中均需保持无菌条件，操作应在洁净通风橱内进行，并使用经80%乙醇清洁的工具。本实验方案使用3至6月龄的成年野生型（WT）或血管生成素-2（Ang-2）功能获得型（GOF）CD1小鼠，性别不限。小鼠基因型鉴定方法参照先前文献¹⁰。 
      注意：80%酒精不能实现器械灭菌，但可最大程度减少所制备样本的污染。
   2. 将所有示踪剂用无菌PBS稀释为2 mM的储备液，并分装后避光保存于-20 °C。
   3. 选择激发/发射光谱不同且可与赖氨酸交联固定的示踪剂，例如（四甲基罗丹明）TMR和（异硫氰酸荧光素）FITC，以确保在通透性检测中，无论是使用荧光显微镜（分别采用TMR或FITC滤光片）还是酶标仪进行荧光测定，两种染料之间....

结果

我们最近发现，在健康状态下，血管生成素-2（Ang-2）功能获得性（GOF）小鼠的脑血管通透性高于对照组小鼠¹⁰在脑卒中诱导的小鼠模型中，研究同样显示，GOF 小鼠的梗死体积更大，血脑屏障通透性更高，相较于对照组同窝小鼠。这些结果表明，血管生成素-2（Ang-2）在血脑屏障通透性调控中具有关键作用。因此，本实验方案采用 GOF 小鼠，并与对照组同窝小鼠进行比较，以描述相关机制 体内 通透性检测。然而，该方法也可应用于任何可改变血脑屏障通透性的疾病模型、转基因小鼠模型或药物处理，正如我们此前所做的那样 ^10,11,12,13.

建议用于.......

讨论

血脑屏障功能障碍与多种神经系统疾病相关，包括原发性和继发性脑肿瘤以及脑卒中。血脑屏障的破坏常伴随危及生命的中枢神经系统水肿。因此，阐明触发血脑屏障开放或关闭的分子机制，对于神经系统疾病的治疗具有重要意义，并被研究人员广泛探究。然而，用于研究血脑屏障通透性的方法 体内 文献中报道的方法常伴随技术难题，这些难题通常与繁琐且依赖主观判断的荧光图像定量分析有关^17,18,19此外，一些方法包含全脑荧光成像，这种方法具有误导性，因为它更多反映的是表层脑血管的通透性，而这些血管并未形成紧密的屏障结构。即使基于客观脑组织吸光度进行定量分析（如伊文思蓝通透性评估），动物通常未进行灌流，导致因残留大量血液成分而产生错误解读。脑组织重量是另一个常未纳入通透性计算的变量，但必须予以考虑，因为血管通透性引发的水肿可增加脑重量，从而影响净通透性的判断。此外，性别差异以及个体间脑重量的自然变异可能掩盖真实的通透性差异。放射性示踪剂如 ¹⁴C.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四甲基罗丹明（TMR）葡聚糖 3kD	Thermosfisher	D3308
异硫氰酸荧光素（FITC）葡聚糖 3kD	Thermosfisher	D3306
氯胺酮（Ketavet）	Zoetis
赛拉嗪（Rompun）	Bayer
0.9% 生理盐水	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1× PBS	Gibco	10010-015
组织基质包埋剂（O.C.T. compound）	Sakura Finetek	4583
37% 甲醛溶液	Sigma	252549-1L	配制 4% 溶液
牛血清白蛋白，第五组分	Roth	8076.3
吐温 X-100	Sigma	T8787
大鼠抗 CD31 抗体，克隆株 MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
山羊抗大鼠 Alexa 568	Molecular Probes	A-11077
山羊抗大鼠 Alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua-Poly/Mount 封片剂	Polyscience Inc	18606
21 号蝶形针	BD	387455
血清采集管	Sarstedt	41.1500.005
2 mL 离心管	Sarstedt	72.695.500
Kimtech 精密擦拭纸	Kimberley-Clark Professional	05511
384 孔黑色板	Greiner	781086
超粘附载玻片（Superfrost Plus）	Thermoscientific	J1800AMNZ
聚四氟乙烯研杵	Wheaton	358029
电动顶置式搅拌器	VWR	VWR VOS 14
酶标仪	Tecan	Infinite M200
冷冻切片机	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 光谱成像共聚焦激光扫描显微镜系统	Nikon
蠕动灌注系统	BVK Ismatec
微量离心机	eppendorf	5415R