Här presenterar vi en mus hjärnan vaskulär permeabilitet analysen använder intraperitoneal injektion av fluorescerande spårämnen följt av perfusion som är tillämplig på djurmodeller av blod – hjärnbarriären dysfunktion. En hemi-hjärnan används för att bedöma permeabilitet kvantitativt och den andra för tracer visualisering/immunfärgning. Proceduren tar 5-6 h för 10 möss.
Blod – hjärnbarriären (BBB) är en specialiserad barriär som skyddar den hjärnan mikromiljö från toxiner och patogener i cirkulationen och upprätthåller hjärnan homeostas. De främsta platserna av barriären är endothelial celler i hjärnan kapillärerna vars barriärfunktion resultat från snäva intercellulära junctions och effluxtransportörer uttryckt på plasmamembranet. Denna funktion regleras av pericyter och astrocyter som tillsammans bildar neurovaskulära enheten (NVU). Flera neurologiska sjukdomar som stroke, Alzheimers sjukdom (AD), hjärntumörer är associerade med en nedsatt BBB. Bedömning av BBB permeabiliteten är därför avgörande att bedöma svårighetsgraden av den neurologiska sjukdomen och framgången för de behandlingsstrategier som anställd.
Vi presenterar här en enkel men robust permeabilitet analysmetod som har använts framgångsrikt i flera mus modeller både genetiska och experimentella. Metoden är starkt kvantitativ och objektiv i jämförelse med tracer fluorescens analysen av mikroskopi som vanligen tillämpas. I denna metod injiceras möss intraperitonealt med en blandning av vattenhaltigt inert fluorescerande spårämnen följt av anesthetizing möss. Hjärt perfusion av djuren utförs före skörd hjärna, njurar eller andra organ. Organ är homogeniserad och centrifugeras följt av fluorescens mätning från supernatanten. Blod dras från hjärt punkteringen strax före perfusion serverar för normalisering ändamål vaskulära facket för. Den vävnad fluorescensen är normaliserad till våt vikt och serum fluorescensen att få en kvantitativ tracer permeabilitet index. För ytterligare bekräftelse, kan kontralaterala hemi-hjärnan bevaras för immunhistokemi utnyttjas för tracer fluorescens visualisering ändamål.
På blod – hjärnbarriären (BBB) består av mikrovaskulära endotelceller (ECs) stöds av intimt förknippade pericyter (PCs), som är ensheathed i den basala lamina, och astrocyter (ACs) som omsluter basalmembranet med slutet-fötterna1 ,2. ECs interagera med flera celltyper som stöder och reglerar barriärfunktionen, primärt ACs och datorer, och även nervceller och mikroglia, varav alla bildar tillsammans den neurovaskulära enheten (NVU). NVU är avgörande för funktionen av BBB, vilket begränsar transport av blodburna toxiner och patogener från att komma in i hjärnan. Denna funktion är ett resultat av åtsittande-föreningspunkt molekyler såsom claudin-5, occludin, zonula occludens-1, som finns mellan ECs och även på grund av verkan av transportörer som p-glykoprotein (P-gp) som efflux molekyler som anger endotelet tillbaka in det fartyg lumen1,2,3. BBB tillåter emellertid för transport av viktiga molekyler såsom näring (glukos, järn, aminosyror) genom specifika transportörer uttryckt på EG plasma membran1,2,3. Det EG-lagret är mycket polariserad med avseende på fördelningen av de olika transportörerna mellan luminala (blod-vända) och abluminal (hjärnan söderläge membran) att tillåta för specifika och vectorial transport funktion4,5 . BBB är skyddande avseende tätt reglerar den CNS-miljön, är det en stor utmaning för CNS drogen leverans i sjukdomar såsom Parkinson med en funktionell BBB. Även i neurologiska sjukdomar med BBB dysfunktion, kan det inte antas att hjärnan drogen leverans ökar särskilt som barriär dysfunktion skulle kunna omfatta skador på de specifika transportör mål till exempel som i Alzheimers sjukdom (AD). I AD, flera beta-amyloid transportörer såsom LRP1, RAGE, P-gp är kända för att vara dysreglerad och därmed inriktning dessa transportörer kan vara fruktlöst6,7,8. BBB är nedsatt i flera neurologiska sjukdomar såsom stroke, AD, meningit, multipel-skleros, och hjärnan tumörer9,10,11. Återställer barriärfunktionen är en avgörande del av den terapeutiska strategin och således sin bedömning är kritisk.
I detta arbete, har vi beskrivit en objektiv och kvantitativ protokoll för permeabilitet assay hos gnagare att vi framgångsrikt tillämpas på flera mus linjer både transgen och experimentell sjukdom modeller10,12,13 ,14. Metoden bygger på en enkel intraperitoneal injektion av fluorescerande spårämnen följt av perfusion av mössen ta bort spårämnen från vaskulära facket. Hjärnan och andra organ är insamlade post perfusion och permeabilitet bedömas av ett objektivt och absolut permeabilitet index baserat på fluorescens mätningar av vävnad homogenates i en spektrofotometer. Alla råa fluorescens värden korrigeras för bakgrunden med vävnad homogenates eller serum från sham djur som inte får någon tracer. Gott om normalizations ingår för serum volym, serum fluorescens och vikten av vävnaderna, vilket således ger permeabilitet index som är absolut och jämförbara mellan experiment och vävnadstyper. För att underlätta jämförelse mellan grupper, kan de absoluta permeabilitet indexvärdena lätt omvandlas till nyckeltal som vi hade utfört tidigare12. Samtidigt skulle lagrade hemi-hjärnor och njure kunna utnyttjas för tracer visualisering av fluorescence mikroskopi10. Den klassiska fluorescensmikroskopi kunde vara värdefullt att få regional skillnad i permeabilitet än besvärligt på grund av subjektiva urval av vävnadssnitt och bilder för en semikvantitativ analys. De detaljerade anvisningarna presenteras i protokoll och anteckningar läggs vid behov. Detta ger nödvändig information för att framgångsrikt utföra permeabilitet analysen i vivo i möss som kan skalas till andra små djur. Analysen kan användas för många typer av spårämnen möjliggör kostnaden och storleken baserat permeabilitet bedömning av en kombination av spårämnen med distinkta fluorescens spectra.
Blod – hjärnbarriären dysfunktion är associerade med ett antal neurologiska sjukdomar, inklusive primära och sekundära hjärntumörer eller stroke. BHB-nedbrytning förknippas ofta med livshotande CNS ödem. Förtydligandet av de molekylära mekanismer som utlöser öppning eller stängning av BBB därför utreds terapeutisk betydelse i neurologiska sjukdomar och ofta av forskare. Men, metoder för att undersöka BBB permeabilitet i vivo rapporteras i litteraturen, är ofta förknippade med tekniska svårig…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna Sphingonet konsortium finansierat av stiftelsen Leduq för att stödja detta arbete. Detta arbete fick också stöd av Collaborative Research Center ”vaskulär differentiering och remodeling” (CRC / Transregio23, projektet C1) och av 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc programmet GO-IN, nr 291776 finansiering. Vi bekräftar vidare Kathleen Sommer för hennes tekniskt bistånd med möss hantering och genotypning.
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
384-well black plate | Greiner | 781086 | |
slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
microcentrifuge | eppendorf | 5415R |