RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi
Summary
Bu yöntem RNA sentezi ölçmek için kullanılabilir. 5-Bromouridine hücrelere eklendi ve sentezlenmiş RNA dahil. RNA sentezi 5 Bromouridine hedeflenmiş immunoprecipitation etiketli RNA ve analiz ters transkripsiyon ve nicel Polimeraz zincir reaksiyonu ardından hemen sonra etiketleme, RNA ayıklama ölçülür.
Abstract
Kararlı duruma RNA düzeyleri arasında iki koşulları karşılaştırıldığında, değişiklikleri değişiklikler üretim veya RNA bozulma nedeniyle olup olmadığını ayırt etmek mümkün değildir. Bu iletişim kuralı RNA üretim, 5-Bromouridine immunoprecipitation, soruşturma bir kısa süre içinde (örneğin, 1 h) sentezlenmiş RNA’ın sağlayan ardından RNA’ın etiketleme kullanarak ölçülmesi için bir yöntemi açıklar. 5-Bromouridine-etiketleme ve immunoprecipitation avantaj α-amanitin ve actinomycin D, gibi toksik transkripsiyon inhibitörleri kullanımı vardır yok veya çok düşük etkileri kısa süreli kullanım sırasında hücre canlılığı. Ancak, 5-Bromouridine-immunoprecipitation sadece kısa etiketleme süre içinde üretilen, yavaş yavaş üretilen gibi hızla bozulmuş RNA yakalar çünkü RNA bu yöntemle ölçmek zor olabilir. 5-Bromouridine-immunoprecipitation tarafından yakalanan 5 Bromouridine etiketli RNA ters transkripsiyon, nicel Polimeraz zincir reaksiyonu ve sonraki nesil sıralama tarafından çözümlenebilir. RNA her türlü incelenmiş ve için yöntem bu örnekte sunulan mRNA ölçme için sınırlı değildir.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) RNA üretim olmayan hücrelerde çalışma izin verir veya çok sınırlı etkisi Fizyoloji dönemi1,2etiketleme kısa sırasında hücre. Bu yöntem etiketli RNA anti-BrU antikorlar (şekil 1) kullanarak IP tarafından BrU yeni sentezlenmiş RNA içine takip sentetik üridin türev birleşme dayanır.
Yıllardır bu protein sentezi transcriptionally düzenlenmiş ve transkripsiyon faktörleri varlığını daha 50 yıl önce olan için bilinmektedir3. Günümüzde, birçok hastalıkları transkripsiyon ve RNA istikrar bozukluk tarafından neden olduğu bilinmektedir (ek şekil S1, başvuru4) ve yeteneği RNA üretim değişiklikleri ölçmek için anlayış hastalığında büyük önem taşıyor geliştirme.
Öte yandan, RNA üretim düzenlenmesi için çözümler çok az ya da çok fazla protein ifade veya Parkinson hastalığı (PD) gibi protein birikimi kaynaklanan hastalıkların tedavisi için yeni olanaklar sağlar. PD olarak çözünmez toplamları biriken baskın α-synuclein proteindir ve α-synuclein gen gen çarpma ailesel PD5nedenleri olarak α-synuclein düzeyini doğrudan hastalığa, bağlı. Ayrıca, α-synuclein bir konsantrasyon bağımlı şekilde toplar. α-synuclein mRNA düzeylerinin downregülasyon bu nedenle başarılı nöronal hücre kaybı PD kemirgen modelleri6,7azaltmak için RNA müdahale kullanarak elde edilmiştir ilginç bir tedavi stratejisi.
Bu hastalık ya da tedavi müdahaleler tarafından neden RNA üretim değişiklikleri ölçmek önemlidir. RNA, ölçüm kararlı duruma düzeyleri gibi nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), tarafından takip ters transkripsiyon transkripsiyon düzenleme nedeni veya değişiklikleri ayırt yeteneğine sahip değildir için en modern yöntemleri değişmiş RNA istikrar. RNA çürüme oranları incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem α-amanitin veya actinomycin D çürüyen RNA’ların ölçümleri tarafından takip gibi bileşikler kullanarak transkripsiyon makine engelliyor. Ancak, transkripsiyon hücrelerde apoptoz8,9indüksiyon gibi genel bir tıkanması ile ilgili bazı sorunlar vardır. Sitotoksik etkileri, transkripsiyon inhibitörleri da hücresel alımını yavaş: α-amanitin ve actinomycin (referans10gözden) D özgüllüğü eksikliği gibi çeşitli teknik sorunlar mevcut.
Transkripsiyon genel tıkanması önlemek için nükleotid analogları, 5-ethynyl üridin (5-AB), 4-thiouridine (4-TU) ve kardeş gibi kullanılmaktadır. Bunlar kolayca memeli hücreleri tarafından alınır ve yeni sentezlenmiş RNA, darbe-etiketleme RNA’ın belirli bir zaman çerçevesinde etkinleştirme dahil. BrU seçim11,12tercih edilen analog yapmak 5-AB ve 4-TU, daha az toksik değildir.
BrU-IP RNA sentezi ve istikrar hem oranı araştırmak ve böylece toplam RNA değişimler nedenleri arasında ayırt etmek için kullanılabilir. Bu makalede RNA sentezi ölçüm üzerinde durulacak ve2 soruşturma RNA istikrar hakkında ayrıntılı bilgi için başvuru başvurur. RNA sentezi araştırmak için hücreleri kısa bir süre ile BrU örneğin 1s BrU-IP1 tarafından (şekil 1 c) ardından için etiketli. Bu ölçümler etiketleme kısa sürede sentezlenmiş RNA’ın sağlar ve gözlenen değişiklikleri düzenlemelerin daha iyi bir tahmin RNA sentezi içinde RT-qPCR tarafından toplam RNA değişiklikleri ölçerek verecektir. Bu, ancak, etiketleme zaman, örneğin, sadece 1 h, olsa bile bozulma hala gözlenen RNA düzeyleri üzerinde bir etkisi olabilir belirtilmelidir.
RNA BrU-IP deneyler üzerinden RT-qPCR1 veya sonraki nesil sıralama2,13tarafından aşağı akım analizi için uygundur. Kuzey kurutma veya ribonükleaz koruma yöntemi, gibi diğer standart RNA algılama yöntemleri de bazı RNA’lar için geçerli olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA üretim, yeni etiketleme tarafından belirlenmesi için 1S BrU, ardından hemen RNA ayıklama ve immunoprecipitation BrU etiketli RNA’ın RNA üretilen için bu protokolü BrU-IP kullanımını açıklar. Bu yöntem daha önce başvuru16açıklandığı ve bu makale IP özgüllük ve RNA saflık, BrU yanı sıra bir fenol kloroform arıtma adıma düşük konsantrasyonları ile önceden tedavi boncuk artırmak için bazı ek adımlar içerir IP takip RNA saflık artırın. Ayrıca, biz de bura…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lundbeck Vakfı, Aarhus Üniversitesi, Dandrite ve Lundbeck A/S bu çalışmaları destekledi.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?. Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. . Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2′-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
