Undersøkelse av RNA syntese med 5-Bromouridine merking og Immunoprecipitation
Summary
Denne metoden kan brukes til å måle RNA syntese. 5-Bromouridine er lagt til celler og innlemmet i syntetisert RNA. RNA syntese måles av RNA utvinning umiddelbart etter merking, etterfulgt av 5-Bromouridine-målrettet immunoprecipitation av merket RNA og analyse av omvendt transkripsjon og kvantitative polymerasekjedereaksjons.
Abstract
Når steady state RNA nivåer sammenlignes mellom to betingelser, er det ikke mulig å skille om forandringer er forårsaket av endringer i produksjon eller degradering av. Denne protokollen beskriver en metode for måling av RNA produksjon, bruker 5-Bromouridine merking av RNA etterfulgt av immunoprecipitation, som gjør etterforskningen av RNA syntetisert innen kort tid (f.eks, 1 time). Fordelen av 5-Bromouridine-merking og immunoprecipitation over bruken av giftige transcriptional hemmere, som α-amanitin og actinomycin D, er at det er ingen eller svært lav effekt på cellen levedyktighet under kortvarig bruk. Men fordi 5-Bromouridine-immunoprecipitation bare fanger RNA produsert innen kort merking tiden, sakte produsert samt raskt forringes kan RNA være vanskelig å måle på denne måten. Den 5-Bromouridine-merket RNA fanget av 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseres av omvendt transkripsjon, kvantitativ polymerasekjedereaksjons og neste generasjons sekvensering. Alle typer RNA kan undersøkes og metoden er ikke begrenset til måle mRNA som presenteres i dette eksempelet.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) tillater studiet av RNA produksjon i celler uten eller svært begrenset effekter på celle fysiologi under kort merking periode1,2. Metoden er basert på innlemmelse av syntetisk uridine derivative BrU i nylig syntetisert RNA etterfulgt av IP av merket med anti-BrU antistoffer (figur 1).
Det har vært kjent for flere tiår at proteinsyntese transcriptionally kan reguleres og eksistensen av transkripsjonsfaktorer var hypotesen mer enn 50 år siden3. I dag, det er kjent at flere sykdommer er forårsaket av feilregulering transkripsjon og RNA stabilitet (supplerende figur S1 i referanse4), og muligheten til å måle endringer i RNA produksjon er av stor betydning i forståelsen sykdom utvikling.
Derimot, gir verktøy å regulere RNA produksjon nye muligheter for behandling av sykdommer forårsaket av for lite eller for mye protein uttrykk eller protein akkumulering som i Parkinsons sykdom (PD). Dominerende protein samler som uløselig mengdefunksjoner i PD er α-synuclein, og nivået av α-synuclein er direkte knyttet til sykdommen, som gene multiplikasjon av α-synuclein genet fører familiær PD5. Videre samler α-synuclein i en konsentrasjon avhengige måte. Downregulation α-synuclein mRNA nivåer er derfor en interessant terapeutiske strategi, som har vært vellykket oppnådd ved hjelp av RNA-interferens redusere neuronal celle tap i PD gnager modeller6,7.
Det er viktig å kunne måle endringene i RNA produksjon skyldes sykdom eller terapeutisk intervensjon. Toppmoderne metoder endret for måling steady state nivåer av som omvendt transkripsjon etterfulgt av kvantitative polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR), ikke kan skille mellom endringer forårsaket av transcriptional regulering eller RNA stabilitet. Brukte metode for undersøkelse av RNA forfall priser er blokkering av transcriptional maskiner bruker forbindelser som α-amanitin eller actinomycin D etterfulgt av målinger av råtnende RNAs. Det er imidlertid noen problemer forbundet med en total blokkering transkripsjon i celler, for eksempel induksjon av apoptose8,9. Foruten de cytotoksiske effektene presentere transcriptional hemmere også flere tekniske problemer som treg mobilnettet opptak av α-amanitin og mangel på spesifisitet av actinomycin D (omtalt i referanse10).
For å unngå total blokkering transkripsjon, brukt nukleotid analoger som 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) og BrU. Disse er lett tatt opp av pattedyrceller og innlemmet i nylig syntetisert RNA, aktivere puls-merking av RNA innenfor en bestemt tidsramme. BrU er mindre toksiske enn 5-EU og 4-TU, gjør det foretrukne analog valg11,12.
BrU-IP kan brukes til å undersøke både frekvensen av RNA syntese og stabilitet, og dermed skille mellom de underliggende årsakene til endringer i totalt RNA. Denne artikkelen vil fokusere på måling av RNA syntese og refererer referanse2 for detaljer om etterforskningen av RNA stabilitet. Undersøke RNA syntese, merkes kort celler med BrU f.eks 1t etterfulgt av BrU-IP1 (figur 1 c). Dette kan målinger av RNA syntetisert i den korte merking tiden og observerte endringer vil gi et bedre estimat av regelverket i RNA syntese enn ved å måle endringer i totalt RNA av RT-qPCR. Det bør nevnes, imidlertid, at selv om merking tiden er, for eksempel bare 1 h, degradering fortsatt har en innflytelse på RNA nivåene observert.
RNA fra BrU-IP eksperimenter er egnet for nedstrøms analyse av både RT-qPCR1 eller neste generasjons sekvensering2,13. Andre standard RNA gjenkjenningsmetoder, som Nord blotting eller ribonuclease beskyttelse analysen, kan også gjelde for enkelte RNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av BrU-IP for fastsettelse av RNA produksjonen av merking av nylig produsert RNA 1t med BrU, etterfulgt av umiddelbar RNA utvinning og immunoprecipitation av BrU-merket. Denne metoden har tidligere blitt beskrevet i referanse16, og denne artikkelen inneholder noen tilleggstrinn for å øke IP spesifisitet og RNA renhet, av pre behandlende perler med lave konsentrasjoner BrU samt et fenol-kloroform rensing skritt øke RNA renhet følgende IP. I tillegg presenterer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lundbeck stiftelsen, Aarhus universitet, Dandrite og Lundbeck A/S støttet dette arbeidet.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?. Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. . Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2′-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
