Utredning av RNA-syntes med 5-Bromouridine märkning och Immunoprecipitation
Summary
Denna metod kan användas för att mäta RNA-syntes. 5-Bromouridine läggs till celler och införlivas syntetiserade RNA. RNA-syntes mäts av RNA-extraktion omedelbart efter märkning, följt av 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation märkta RNA och analys av omvänd Transkription och kvantitativa polymeras-kedjereaktion.
Abstract
När steady state RNA-nivåer jämförs mellan två villkor, är det inte möjligt att särskilja huruvida förändringar orsakas av förändringar i produktionen eller nedbrytning av RNA. Det här protokollet beskriver en metod för mätning av RNA produktion, med hjälp av 5-Bromouridine märkning av RNA följt av immunoprecipitation, som möjliggör undersökning av RNA syntetiseras inom en kort tidsram (t.ex., 1 h). Fördelen med 5-Bromouridine-märkning och immunoprecipitation över användningen av giftiga transkriptionell hämmare, såsom α-amanitin och actinomycin D, är att det finns ingen eller mycket låg effekt på cellernas viabilitet under kortvarig användning. Eftersom 5-Bromouridine-immunoprecipitation endast fångar RNA produceras inom den korta tid som märkning, långsamt produceras samt snabbt försämrad kan RNA dock svårt att mäta med denna metod. 5-Bromouridine-märkt RNA fångas av 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseras genom omvänd Transkription, kvantitativa polymeraskedjereaktion och nästa generations sekvensering. Alla typer av RNA kan utredas, och metoden är inte begränsad till att mäta mRNA som presenteras i detta exempel.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) tillåter studier av RNA produktion i celler med inga eller mycket begränsade effekter på cell fysiologi under den korta märkning perioden1,2. Metoden bygger på införlivandet av syntetiska uridin derivatan BrU i nyligen syntetiserade RNA följt av IP märkta RNA med hjälp av anti-BrU antikroppar (figur 1).
Det har varit känt för årtionden att proteinsyntesen transcriptionally kan regleras, och förekomsten av transkriptionsfaktorer antogs i mer än 50 år sedan3. Idag, det är känt att flera sjukdomar orsakas av dysreglering av transkription och RNA stabilitet (kompletterande figur S1 i referens4), och förmågan att mäta förändringar i RNA produktion är av stor betydelse för förståelse sjukdom utveckling.
Å andra ger verktyg att reglera RNA produktionen nya möjligheter för behandling av sjukdomar som orsakas av för lite eller för mycket proteinuttryck eller protein ackumulering som vid Parkinsons sjukdom (PD). Det dominerande proteinet ackumulera som olösliga aggregat i PD är α-synuclein, och nivån på α-synuclein är direkt kopplad till sjukdomen, eftersom genen multiplikation av α-synuclein genen orsakar familjär PD5. Dessutom aggregerar α-synuclein i en koncentration koncentrationsberoende sätt. Nedreglering av α-synuclein mRNA nivåer är därför en intressant terapeutisk strategi, som har infriats med RNA-interferens för att minska neuronala cellförlust i PD gnagare modeller6,7.
Det är viktigt att kunna mäta förändringar i RNA produktion orsakas av antingen sjukdom eller terapeutiska interventioner. Toppmodern metoder ändras för mäta steady state-nivåer av RNA, såsom omvänd Transkription följt av kvantitativa polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR), inte kunna skilja mellan förändringar orsakade av Transkriptionsreglering eller RNA stabilitet. En allmänt använd metod för utredning av RNA decay priser blockering av transkriptionell maskinen använder föreningar såsom α-amanitin eller actinomycin D följt av mätningar av ruttnande RNASEN. Det finns dock vissa problem i samband med en total blockering av transkription i celler, såsom induktion av apoptos8,9. Bredvid de cytotoxiska effekterna presentera transkriptionell hämmare också flera tekniska frågor, såsom långsam cellernas upptag av α-amanitin och bristande specificitet av actinomycin D (ses i referens10).
För att undvika en total blockering av transkription, har nukleotid analoger använts, såsom 5-ethynyl uridin (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) och BrU. Dessa är lätt tas upp av däggdjursceller och införlivas med nyligen syntetiserade RNA, aktivera puls-märkning av RNA inom en viss tidsram. BrU är mindre giftig än 5-EU och 4-TU, gör det det föredragna analogt val11,12.
BrU-IP kan användas för att undersöka både graden av RNA-syntes och stabilitet, och därmed skilja mellan de underliggande orsakerna till förändringar i total-RNA. Denna artikel kommer att fokusera på mätning av RNA-syntes och avser referens2 för information om utredning av RNA stabilitet. För att undersöka RNA-syntes, är celler kort märkta med BrU t.ex. för 1 h följt av BrU-IP1 (figur 1 c). Detta möjliggör mätningar av RNA syntetiseras inom den korta tid som märkning och observerade förändringar kommer att ge en bättre uppskattning av förordningar i RNA-syntes än genom att mäta förändringar i total-RNA av RT-qPCR. Det bör dock nämnas att även om märkning tiden är, till exempel endast 1 h, nedbrytning kan fortfarande påverka de RNA-nivåer som observerats.
RNA från BrU-IP experiment lämpar sig för efterföljande analys av både RT-qPCR1 eller nästa generations sekvensering2,13. Andra standard RNA upptäckt metoder, såsom norra blotting eller ribonunkleas analys, kan också vara tillämpliga för vissa RNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver användningen av BrU-IP för bestämning av RNA produktion av märkning av nyligen producerade RNA för 1 h med BrU, följt av omedelbar RNA-extraktion och immunoprecipitation BrU-märkt RNA. Denna metod har tidigare beskrivits i referens16, och den här artikeln innehåller några ytterligare steg för att öka IP-specificitet och RNA renhet, genom pre behandlande pärlor med låga koncentrationer av BrU samt en fenol-kloroform reningssteg till öka RNA renhet efter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stiftelsen Lundbeck, Århus universitet, Dandrite och Lundbeck A/S stöds detta arbete.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?. Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. . Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2′-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
