Обнаружение CDH1 редких Стенограмма вариант в тканях свежемороженые рака желудка на основе чипа цифровой ПЦР
Summary
Рукопись описывает на основе чипа цифровой ПЦР анализа обнаружить редкий вариант Стенограмма CDH1 (CDH1a) в свежезамороженной нормальных и опухолевых тканей, полученных от пациентов с раком желудка.
Abstract
CDH1a, нестандартные Транскрипт гена CDH1 , было установлено, выражаться в некоторых линий клетки рака желудка (GC), тогда как она отсутствует в нормальной слизистой оболочки желудка. Недавно мы обнаружили CDH1a Стенограмма вариант в свежезамороженной опухолевых тканей, полученных от больных с GC. Выражение этого варианта в образцах тканей были исследованы чип-подход на основе цифровой ПЦР (dPCR) представлены здесь. dPCR предлагает возможности для точной, надежной и высокочувствительный измерения нуклеиновых кислот и все чаще используется для многих приложений в различных областях. dPCR способен обнаруживать редких целей; Кроме того dPCR предлагает возможность абсолютного и точной количественной оценки нуклеиновых кислот без необходимости для калибраторов и стандартных кривых. В самом деле секционирование реакции обогащает целевой объект от фона, который улучшает эффективность усиления и терпимости к ингибиторам. Такие характеристики делают dPCR оптимальный инструмент для выявления редких стенограмме CDH1a .
Introduction
CDH1 ген кодирует для E-Кадгерины, участвующих в поддержании нормальной желудка эпителия через регулирование клеток адгезии, выживание, распространением и миграции1является ключевым фактором. Потеря E-Кадгерины белка в результате пагубного микрофлорой или соматические изменения CDH1 был связан с развитием GC2,3. Non канонические стенограммы, вытекающих из Интрон 2 гена также предположить, чтобы играть роль в желудка канцерогенеза4,5. В частности, один из таких стенограмма, CDH1a, было показано, что выражается в GC клеточных линий, но отсутствует от нормальной желудке4. Мы недавно обнаруженных CDH1a в образцах тканей GC от GC больных с использованием основанных на чип dPCR5. dPCR был использован для оценки, в первый раз, присутствие Транскрипт гена CDH1a в кишечных GC и в нормальной ткани.
Метод золотого стандарта для определения экспрессии генов является Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР). Однако результирующие данные могут иногда быть переменной и плохого качества, особенно когда уровень целевого в образце является низким. Эта изменчивость может быть вызвано примеси, которые ингибируют активность полимеразы и отжига праймера, усиление неспецифической и конкурентные стороны реакции6.
Хотя основные принципы биохимических dPCR аналогичны ПЦР, dPCR показывает некоторые преимущества, позволяющие очень точные измерения геномной ДНК (геномная ДНК) / дополнительные молекулы ДНК — (cDNA кДНК). Действительно dPCR является конечной точки реакции, которая опирается на калиброванных разделения образца на тысячи скважин, так что каждый хорошо содержит ноль или молекуле одну цель. Усиление затем происходит только в скважинах, содержащий копию целевого и обозначается флуоресцентного сигнала. Абсолютное количество молекул-мишеней в исходного образца вычисляется путем определения соотношения позитивного для всего разделов с помощью Биномиальное Пуассона статистика7.
Кроме того, метод dPCR устраняет необходимость для запуска стандартной кривой и, следовательно, связанные предвзятости и изменчивости, что позволяет прямой количественной оценке цели8,9; Она производит более точные и воспроизводимые результаты независимо от загрязнений и эффективности из-за его высокой толерантностью к ингибиторы10; Это более чувствительной, чем ПЦР и таким образом является надежным методом для выявления редких целевого объекта. Наконец секционирование образца на несколько реакций снижает конкуренцию с фон молекул и повышает предел обнаружения целей, делая возможным усиление и облегчения выявления одной молекулы геномная ДНК/cDNA6 . Обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот, основанные на чипе dPCR чаще применялся скопировать номер изменения, количественного определения ДНК фрагментов и мутации анализирует11,12,13, учитывая точность и низкий материал ввода требование метода. Кроме того dPCR недавно было включено в анализ обоих микроРНК14 гена стенограммы5,и15.
Protocol
Representative Results
Discussion
dPCR был первоначально разработан для ДНК молекулярные измерения10,11,12,13 и время, когда эта технология была адаптирована для количественной оценки микроРНК и РНК стенограммы5, 14,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Грайне Тирни для редакционной помощи.
Materials
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
References
- van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
- Carneiro, P., et al. E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions. FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).
- Corso, G., et al. Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer. J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).
- Pinheiro, H., et al. Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis. Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).
- Abou Khouzam, R., et al. Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer. Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. 7 (1), (2017).
- Basu, A. S. Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR. SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).
- Huggett, J. F., Whale, A. Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics. Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).
- Alikian, M., et al. RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia. Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).
- Hoshino, T., Inagaki, F. Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR. Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Tessitore, M. V., et al. Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs. J.Transl.Med. 15 (1), (2017).
- Sho, S., et al. Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens. PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).
- Conte, D., et al. Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR. BMC Genomics. 16, 849 (2015).
- Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification. PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).
