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Chemistry

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Abstract

Die genetische Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) über Bernstein Stopp-Codon Unterdrückung ist eine leistungsstarke Technik, künstliche Sonden und reaktive Moieties auf Proteine direkt in der live Zelle zu installieren. Jede ncAA ist durch eine spezielle orthogonale Suppressor-tRNA/amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) Paar aufgenommen, die in den Wirtsorganismus importiert wird. Die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs kann stark unterschiedlich und in einigen Fällen unbefriedigend sein. Orthogonale Paare können verbessert werden durch die Manipulation der AARS oder der tRNA. Gerichtete Evolution von tRNA oder AARS mit großen Bibliotheken und tot/lebendig Auswahlmethoden sind jedoch nicht machbar in Säugetierzellen. Hier ist eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays, die Effizienz der orthogonalen Paare in Säugetierzellen zu bewerten präsentiert. Der Test ermöglicht screening Dutzende bis Hunderte von AARS/tRNA-Varianten mit mäßigem Aufwand und innerhalb eines angemessenen Zeitraums. Verwendung des Assays neue tRNAs generieren, die deutlich die Effizienz der Pyrrolysin orthogonalen System beschrieben ist, zusammen mit der Anwendung von NcAAs zur Erforschung der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die Objekte eine für ncAA Herausforderung sind Mutagenese. Erstens werden durch die systematische Integration eine Foto-Vernetzung ncAA in der extrazellulären Oberfläche eines Rezeptors, Bindungsstellen der verschiedenen Liganden auf den intakten Rezeptor direkt in der live Zelle zugeordnet. Zweite, durch den Einbau von NcAAs der letzten Generation in einem GPCR, ultraschnelle Katalysator-freie Rezeptor Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Farbstoff ist gezeigt hat, nutzt die Bioorthogonal Belastung gefördert inverse Diels Alder Cycloaddition (SPIEDAC) auf die live-Zelle. Wie NcAAs in der Regel auf jedem Protein unabhängig von dessen Größe angewendet werden kann, ist die Methode von allgemeinem Interesse für eine Reihe von Anwendungen. Darüber hinaus ncAA Einarbeitung erfordert keine spezielle Ausrüstung und erfolgt im standard Biochemie Labor.

Introduction

Die genetische Einbeziehung der chemischen Sonden in Proteinen ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der strukturellen und dynamischen Aspekte der Proteinfunktion direkt im heimischen Kontext der live Zelle zu erleichtern. Heute können Hunderte von nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs), ausgestattet mit den verschiedensten chemischen Gruppen ortspezifisch Proteine durch Biosynthese1,2,3,4integriert werden. Dazwischen findet man lichtempfindliche NcAAs wie Foto-Vernetzer5, Foto-Käfig6,7,8,9 und Foto-schaltbare Aminosäuren10, 11, Aminosäuren mit angespannten Alkenen und Alkinen für Katalysator-freie Bioorthogonal Chemie2,12,13,14,15,16 ,17, Aminosäuren tragen Dansyl18, Cumarin9,19und21 Fluorophore prodan20,und Aminosäuren ausgestattet mit anderen biophysikalischen Sonden als sowie mit den Post translationale Modifikationen1,2,3,4,22,23,24,25.

Die genetische Codierung eine ncAA wird ermöglicht durch eine dedizierte amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) gekoppelt an ein cognate Suppressor-tRNA, die der ncAA in Reaktion auf eine bernsteinfarbene Stopcodon während der regelmäßige ribosomale Synthese enthält. NcAARS/tRNA-Paare sind so konstruiert, um im Wirtsorganismus, d. h. nicht mit den endogenen paar Übersprechen orthogonal sein. Die Technik ist gut etabliert, sowohl in prokaryotischen und eukaryotischen Gastgeber und leicht anwendbare, Säugetier-Zellen. Paare zum ncAA Einbau in Säugerzellen basieren auf drei orthogonalen Hauptsysteme: das Tyrosyl-System, das die TyrRS von E. Coli26 mit einem Tyrosyl Bernstein-Schalldämpfer von B. Stearothermophilus27 (EG kombiniert TyrRS /BstYam Paar), die E. Coli Leucyl System (EGLeuRS/tRNALeuCUA Paar)6,18,28 und die Archaeen Pyrrolysyl-System (PylRS/tRNA Pyl Paar)3, wobei die tRNAPyl ist ein natürlicher Bernstein Suppressor. Im Allgemeinen ist eine spezialisierte NcAARS jedes ncAA anerkannt. Abhängig von der Struktur der ncAA erhält man die NcAARS durch gerichtete Evolution von TyrRS, LeuRS oder PylRS, obwohl einige synthetasen mehrere ncAA akzeptieren können.

Das orthogonale Paar wird in die Zellen importiert, indem Sie einfach ein Plasmid-Vektor. Am meisten common und effiziente Plasmide sind Bicistronic und sowohl für die synthestase und die tRNA bilden die orthogonale Paar29zu kodieren. Eine zweite Plasmid-Codierung für das Protein des Interesses trägt eine gelbe Codon am Standort für die Änderung ist Co transfizierten. Die ncAA ist einfach das Wachstumsmedium Zelle hinzugefügt. Jedoch verwenden verschiedene Fachgruppen oft verschiedene Varianten von Plasmid Konstrukte auch für die Aufnahme der gleichen ncAA. Konstrukte unterscheiden sich in der Anordnung der Gene in den Vektor, der synthestase, Codon Usage synthestase gen, Projektträger Nutzung, Variante der tRNA und Anzahl der tRNA Expressionskassetten. Darüber hinaus kann die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs drastisch aufgrund der verschiedenen katalytische Effizienz der verschiedenen synthetasen, die Qualität der tRNA und anderen Faktoren30variieren. Daher ist es wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Bewertung der Effizienz eines orthogonalen Pairs, die am besten geeignete System für eine gewünschte Anwendung auswählen und einige Optimierungsschritte durchführen, die Verbesserung der Gesamt-Protein-Expression zur hand zu haben Renditen.

Wir haben eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare29 (Abbildung 1) etabliert. Zellen sind in der Probe Co transfected mit der Plasmid-Codierung für das orthogonale Paar, zusammen mit einem Bicistronic Reporter Plasmid Codierung sowohl für das grün fluoreszierende Protein trägt eine gelbe Stopcodon an einer freizügigen Position (EGFP-TAG) und die mCherry gen. Rote und grüne Fluoreszenz der gesamten Zelle Lysates werden in getrennten Kanälen auf einem Teller-Leser in einer 96-Well-Platte gelesen. Die Intensität der grünen Fluoreszenz korreliert direkt mit der Effizienz der Bernstein Unterdrückung, während die Intensität der rote Fluoreszenz eine direkte Schätzung der Größe der gemessenen Probe und die Transfektion Effizienz gibt. In Bezug auf ähnliche Tests basierend auf Fluoreszenz assistierten Zelle Sortieren (FACS) ausgelesen31,32, Assays gibt eine sofortige und umfassende Bewertung der Proteinexpression in der gesamten Zellpopulation, die mehr Vertreter der üblichen experimentellen Bedingungen, und bietet eine einfachere Datenerfassung und Verarbeitung mit standard-Software. Insgesamt ist der Hauptvorteil des Tests, dass ein Medium, um eine große Anzahl von Proben parallel analysiert werden kann. Mit Hilfe dieses Tests, haben wir eine rational konzipierte Bibliothek von Suppressor-tRNAs zur Verbesserung der Effizienz der Pyl orthogonalen System30gezeigt. Diese Arbeit beschreibt das experimentelle Protokoll zum Durchführen dieser Assay und zeigen Beispiele für seine Anwendung, einschließlich der Optimierung des orthogonalen Paares für die Einbeziehung von der Foto-Vernetzung ncAA p-Azido-L-Phenylalanin (Azi) und den Vergleich der Einbindung Wirkungsgrade verschiedener Aminosäuren (Abbildung 2).

In den letzten Jahren ncAA Werkzeuge sind sehr mächtig, um strukturelle Untersuchung nachgewiesen worden und funktionalen Aspekte des G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. beim Menschen GPCRs bilden eine große Familie von Membranrezeptoren (800 Mitglieder) und Hauptziele für therapeutische Drogen darstellen. Direkte strukturelle Charakterisierung von GPCRs ist immer noch anspruchsvoll und ergänzende biochemische Methoden sind hoch für ihre Untersuchung erforderlich. Wir sind Pionier im Einsatz von Foto-Vernetzung NcAAs GPCR Oberflächen abbilden und Ligand verbindliche Taschen34zu entdecken. Mit unserem optimierten System Azi Aufnahme haben wir systematisch Azi in der ganzen Juxtamembrane Domäne von GPCR direkt in lebenden Säugetier-Zellen aufgenommen. Bei UV-Bestrahlung bildet Azi eine hochreaktive Nitrene Spezies, die benachbarten Moleküle kovalent erfasst. Wenn die Liganden zum System hinzugefügt wird, dient Azi als ein Näherungssensor zu offenbaren, welche Positionen des Rezeptors in der Nähe der gebundenen Liganden kommen. Auf diese Weise wurde der Bindungsmodus des Hormons Neuropeptid Urocortin ich (Ucn1) auf die Klasse B GPCR Corticotropin-freigeben-Faktor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R)33 erstmals vorgestellt. In letzter Zeit, haben wir unterschiedliche verbindliche Muster von Agonisten und Antagonisten auf die gleichen Rezeptor38offengelegt. Ein ähnlicher Ansatz wurde von anderen Orthosteric und allosterische Bindungsstellen anderer Peptide und niedermolekularen Liganden auf andere GPCRs39,40,41,42offenbaren angewendet. Dieses Manuskript beschreibt das experimentelle Protokoll in unserem Labor für Foto-Vernetzung Zuordnung von GPCR Oberflächen angewendet. Die Methode ist relativ schnell, unkompliziert und erfordert keine spezielle Ausrüstung, so dass es im standard Biochemie Labor anwendbar ist. Wichtig ist, der Ansatz bietet ein wertvolles Instrument, nicht nur um Ligand verbindliche Aufstellungsorte zu identifizieren, wo 3D Strukturdaten sind knapp, sondern auch zur Ergänzung der vorhandenen in-vitro- Daten mit Informationen aus voll posttranslational modifizierte Rezeptoren in der physiologische Umgebung der Zelle Leben.

Die jüngste Entwicklung von neuartigen NcAAs Lager auf der Seite Kette chemischen Gruppen geeignet für ultraschnelle Katalysator-freie Bioorthogonal-Chemie hat eröffnet die Möglichkeit, letzte Generation Fluorophore für super-Resolution Imaging in Proteine zu installieren direkt auf die Zellen2,43. Diese chemische Dübel sind gespannte Cyclooctyne in SCOK14, Bicyclo [6.1.0] Nonyne BCNK12,17und Trans-Cyclooctenes TCO * K13,15,17 unter anderen NcAAs beherbergen eine Norbornen16,17,44 oder Cyclopropen45,46 Glyko-. Sperrige NcAAs für Bioorthogonal Chemie fließen durch eine Variante des PylRS, die in der Regel als PylRSAF bezeichnet (Angabe Mutation Y271A und Y349F in M. Barkeri PylRS), sowie durch andere ad-hoc- entwickelt NcAARSs17 , 44. Bioorthogonal Anker mit kurz Reagenzien47 über inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition Kennzeichnung ertragreich innerhalb von wenigen Minuten43,48zu reagieren. Anwendung dieses leistungsstarken Konzepts Label GPCRs hat jedoch durch einen niedrigen Gesamtwirkungsgrad des orthogonalen ncAA Einbeziehung Systems streitig gemacht. Mit unserem erweiterten Pyl-System haben wir vor kurzem hochverzinsliche Berücksichtigung solcher Aminosäuren GPCRs und ultraschnelle GPCR Kennzeichnung auf der Oberfläche des lebenden Säugetier-Zellen30gezeigt. Beschriftete Rezeptoren waren noch funktionsfähig, da sie physiologisch, beim Aktivieren des Agonist-Rezeptors verinnerlicht. Das experimentelle Protokoll für die Einbeziehung von Bioorthogonal in GPCRs Anker und die folgende Kennzeichnung Schritte werden hier beschrieben. GPCRs mit kleinen hellen Fluorophore auszustatten, ist der erste grundlegende Schritt zur Studie von GPCR Strukturdynamik in der live-Zelle über erweiterte mikroskopiertechniken.

Protocol

(1) Fluoreszenz-basierten Screening der Einbeziehung Wirkungsgrade (Abbildung 1) HEK293 Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium zu erhalten (DMEM; hohe Glukose, 4 mM Glutamin, Pyruvat) mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt. Samen der Zellen am Vortag Transfektion. Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM…

Representative Results

Die Umrisse der Fluoreszenz-Test ist in Abbildung 1dargestellt. Der Test ist in drei Anwendungen eingesetzt. An erster Stelle werden eine Reihe von tRNA-Varianten für den Einbau des Lys(Boc) durch die Pyl orthogonal paar gezeigt. Lys(BOC) ist eine Aminosäure Pyl sterisch ähnlich. Pyl nicht kommerziell verfügbar ist, wird Lys(Boc) häufig als standard Substrat für die PylRS verwendet. Die abgeschirmten tRNAs basieren auf der tRNAPyl. Jede tRNA-…

Discussion

Das Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare für die Einbindung der NcAAs in Proteine in Säugetierzellen. Der Hauptvorteil dieser Methode in Bezug auf weit verbreiteten Tests basierend auf FACS ist, dass es die gleichzeitige Zubereitung und Messung einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht und liefert Daten, die leicht mit einem normalen Software analysiert werden. Die Verfügbarkeit einer Medium-Durchsatz-Methode zur orthogonalen Paare in Säug…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unter Stipendien CO822/2-1 (Emmy-Noether-Programm) und CO822/3-1 bis I.C gegründet

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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