JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

تحسين إدماج الجينية الكيميائية تحقيقات في جبكرس لرسم خرائط الصور-crosslinking والكيمياء بيورثوجونال في خلايا الثدييات الحية

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

يرد مقايسة fluorescence سهلة لتقييم كفاءة أزواج الأمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز/الحمض الريبي النووي النقال دمج البروتينات في خلايا الثدييات غير المقبول-الأحماض الأمينية (ncAAs). ويرد وصف تطبيق ncAAs لدراسة مستقبلات مقترنة بالبروتين G (جبكرس)، بما في ذلك رسم الخرائط crosslinking صور لربط المواقع ووسم هذه العملية بيورثوجونال على الخلايا الحية.

Abstract

إدراج الوراثية من الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) عن طريق قمع كودون وقف العنبر تقنية قوية لتثبيت المجسات مصطنعة ومويتيس رد الفعل على البروتينات مباشرة في الخلية الحية. هو إدماج كل نكا مكرسة متعامد القامع-الحمض الريبي النووي النقال/أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) زوج التي يتم استيرادها إلى الكائن الحي المضيف. يمكن تختلف كفاءة إدماج ncAAs مختلفة إلى حد كبير، وغير مرضية في بعض الحالات. ويمكن تحسين أزواج المتعامدة عن طريق التلاعب AARS أو الحمض الريبي النووي النقال. ومع ذلك، التطور الموجه للحمض الريبي النووي النقال أو AARS استخدام مكتبات كبيرة وأساليب الاختيار الميت/على قيد الحياة ليست ممكنة عمليا في خلايا الثدييات. ويرد هنا، سهلة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد في خلايا الثدييات. يسمح الفحص فحص عشرات ومئات متغيرات AARS/الحمض الريبي النووي النقال بجهد معتدل وضمن فترة زمنية معقولة. استخدام هذا التحليل لتوليد ترنس الجديدة التي تحسن كفاءة نظام متعامد بيروليسيني هو وصف، جنبا إلى جنب مع تطبيق ncAAs لدراسة البروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، التي تشكل تحديا الكائنات للرابطة الوطنية لرياضة الطفرات. أولاً، من خلال دمج بانتظام نكا صور–كروسلينكينج في جميع أنحاء سطح مستقبلات الخلية، يتم تعيين مواقع الربط من يغاندس مختلفة على مستقبلات سليمة مباشرة في الخلية الحية. الثانية، بتضمين ncAAs الجيل الأخير هذه العملية، فائق السرعة مجاناً محفز مستقبلات وسم بصبغة فلورسنت ويتجلى، الذي يستغل بيورثوجونال تروج لها سلالة معكوس “الدر ديلس” سيكلواديتيون (سبيداك) في الخلية الحية. كما يمكن تطبيق ncAAs عموما أي البروتين بشكل مستقل في حجمه، الأسلوب للمصلحة العامة لعدد من التطبيقات. وباﻹضافة إلى ذلك، إدراج نكا لا يتطلب أي معدات خاصة، ويتم بسهولة في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية.

Introduction

إدماج المجسات الكيميائية الوراثية في البروتينات وسيلة قوية لتسهيل التحقيق في الجوانب الهيكلية والديناميكية لوظيفة البروتين مباشرة في سياق الأصلية من الخلية الحية. في الوقت الحاضر، مئات أحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) مجهزة بمجموعات كيميائية الأكثر المتباينة يمكن سيتيسبيسيفيكالي إدراجها في البروتينات تخليق الحيوي1،2،،من34. بينهما، يجد المرء ncAAs المراعية للصور مثل الصور-كروسلينكيرس5و صور قفص6،7،،من89 والأحماض الأمينية-صور للتحويل10، 11، والأحماض الأمينية التي تحمل الالكينات المتوترة والكينس بيورثوجونال خالية من محفز الكيمياء2،،من1213،14،15،16 ،17والأحماض الأمينية التي تحمل دانسيل18و9،الكومارين19و21 برودان20،فلوروفوريس، ومجهزة بالمسابير الفيزيائية الحيوية الأخرى الأحماض الأمينية وكما هو الحال مع وظيفة التعديلات متعدية الجنسيات1،2،3،4،،من2223،24،25.

يتم تمكين الترميز الوراثي من نكا مخصصة أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) إقران إلى المشابهة القامع-الحمض الريبي النووي النقال، الذي يتضمن نكا ردا على كودون وقف العنبر خلال التوليف ريبوسومال العادية. أزواج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال صممت كي يكون متعامد في الكائن المضيف، أي لا عبر الحديث مع أزواج الذاتية. هذا الأسلوب راسخة في المضيفين بدائية وحقيقية النواة والخلايا تنطبق بسهولة على الثدييات. أزواج لإدماج نكا في خلايا الثدييات تستند إلى نظم متعامد الرئيسية الثلاثة: النظام تيروسيل، الذي يجمع بين تيرس من كولاي26 مع القامع العنبر تيروسيل من ستيروثيرموفيلوس باء-27 (Ec تيرس/زوج يامبتوقيت جنوب بريطانيا)، كولاي ليوسيل نظام (المفوضية الأوروبية/الحمض الريبي النووي النقاللويكوا زوج)6،،من1828 ونظام بيروليسيل أرتشايال (بيلرس/الحمض الريبي النووي النقال برونتوسوروس زوج)3، الذي بموجبه الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس القامع العنبر طبيعي. وبصفة عامة، كل نكا يعترف به نكارس متخصصة. اعتماداً على هيكل ncAA، يتم الحصول عليها في نكارس عن طريق التطور الموجه تيرس أو التي أو بيلرس، على الرغم من أن بعض سينثيتاسيس يمكن قبول أكثر من الرابطة الوطنية لرياضة.

يتم استيراد الزوج متعامد إلى الخلايا ببساطة استخدام ناقل بلازميد. والبلازميدات الأكثر شيوعاً وكفاءة بيسيسترونيك وترميز سواء بالنسبة سينثاتيز والحمض الريبي النووي النقال تشكيل زوج متعامد29. ترميز بلازميد الثاني لبروتين فوائد كودون العنبر في موقع مخصص للتعديل ترانسفيكتيد المشترك. نكا بساطة إضافة إلى متوسط نمو الخلية. ومع ذلك، غالباً ما تستخدم مختلف المجموعات المتخصصة أنواع مختلفة من بنيات بلازميد حتى بالنسبة لإدماج نكا نفس. بنيات تختلف في ترتيب الجينات في ناقلات، نوع من سينثاتيز كودون الاستخدام في الجينات سينثاتيز، استخدام المروج، والبديل للحمض الريبي النووي النقال وعدد الأشرطة التعبير الحمض الريبي النووي النقال. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تختلف فعالية إدماج ncAAs مختلفة جذريا بسبب كفاءة الحفاز مختلفة سينثيتاسيس مختلفة، ونوعية الحمض الريبي النووي النقال، و العوامل الأخرى30. ولذلك، من المهم أن يكون في متناول اليد طريقة سريعة وموثوق بها لتقييم كفاءة زوج متعامد، سواء في اختيار النظام الأكثر ملاءمة لتطبيق المطلوب والقيام ببعض خطوات التحسين التي تحسن عموما البروتين التعبير غلة.

وقد أنشأنا بسيطة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد29 (الشكل 1). في التحليل، خلايا transfected اشتركت مع بلازميد الترميز لزوج متعامد، جنبا إلى جنب مع بلازميد مراسل بيسيسترونيك ترميز سواء بالنسبة للبروتينات الفلورية الخضراء واضعة كودون وقف العنبر في موقف متساهلة (اجفبالعلامة) مشري الجينات. تتم قراءة الأسفار الحمراء والخضراء لكامل الخلية ليساتيس في قنوات منفصلة عن قارئ لوحة في لوحة 96-جيدا. كثافة الفلورية الخضراء مباشرة يرتبط بالكفاءة لقمع العنبر، حين يعطي كثافة ومضان أحمر تقدير حجم العينة المقاسة وكفاءة تعداء مباشرة. فيما يتعلق بفحوصات مماثلة تستند إلى الأسفار تلا مساعدة الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)32من31،، المقايسة يعطي تقييما فوريا وشاملاً للتعبير البروتين في السكان خلية كله، الذي أكثر تمثيلية من الظروف التجريبية المعتادة، ويقدم أكثر سهولة الحصول على البيانات وتجهيز مع البرامج القياسية. عموما، الميزة الرئيسية للفحص أنه وسيلة لعدد كبير من العينات يمكن تحليلها بالتوازي. استخدام هذا الفحص، ونحن قد فحص مكتبة مصممة بطريقة رشيدة من ترنس القامع لتحسين كفاءة نظام متعامد برونتوسوروس30. ويصف هذا العمل البروتوكول التجريبي القيام بهذا التحليل وإظهار أمثلة على تطبيقه، بما في ذلك الاستفادة المثلى زوج متعامد لإدراج الصور-كروسلينكينج نكا فأزيدو-L-فينيلالاناين (العازي) ومقارنة إدماج الكفاءات من الأحماض الأمينية مختلفة (الشكل 2).

على مدى السنوات الماضية، ثبت نكا أدوات قوية جداً للتحقيق في الهيكلية والجوانب الفنية للبروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)33،34،35،،من3637 , 38-في البشر، وتكوين أسرة كبيرة من الغشاء مستقبلات (800 عضو) جبكرس وتمثل الأهداف الرئيسية للعقاقير العلاجية. الوصف الهيكلي مباشرة من جبكرس لا تزال صعبة وأساليب البيوكيميائية التكميلية العالية اللازمة للتحقيق فيها. نحن رائدة استخدام ncAAs كروسلينكينج صور لخريطة GPCR السطوح واكتشاف يجند ملزمة جيوب34. استخدام نظامنا الأمثل لإدماج عُزي، ادخلنا بانتظام عُزي عبر المجال جوكستاميمبراني كله من هذه العملية مباشرة في خلايا الثدييات الحية. عند إشعاع الأشعة فوق البنفسجية، عُزي أشكال أنواع نيتريني شدة رد الفعل الذي يلتقط الجزيئات المجاورة تساهمي. عندما تتم إضافة يجند للنظام، عُزي بمثابة تحقيق قرب تكشف فيها مواقف المستقبلات تقترب من يجند منضم. وبهذه الطريقة، وضع الربط من هرمون نيوروبيبتيدي أوروكورتين (Ucn1) على مستقبلات فئة GPCR ب كورتيكوتروبين-تحرير-عامل الكتابة 1 (CRF1R)33 كان أول كشف النقاب عنها. في الآونة الأخيرة، ونحن كشفت عن أنماط ملزمة مميزة ليضع والخصوم على مستقبلات نفس38. طبق نهج مماثل قبل الآخرين للكشف عن أورثوستيريك ومواقع ربط اللوستيريك الأخرى الببتيدات والجزيئات الصغيرة يغاندس على الأخرى جبكرس39،40،،من4142. ويصف هذه المخطوطة البروتوكول التجريبي المطبق في لدينا مختبر لرسم خرائط الصور-كروسلينكينج للسطوح GPCR. الطريقة سريعة نسبيا، واضحة ولا يتطلب أي معدات خاصة، حيث أنها تنطبق في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية. الأهم من ذلك، يوفر هذا النهج أداة قيمة ليس فقط لتحديد مواقع الربط يجند فيها البيانات الهيكلية 3D نادرة، ولكن أيضا تكملة الموجودة في المختبر البيانات مع معلومات من مستقبلات معدلة تماما بوستترانسلاتيونالي في البيئة الفسيولوجية للخلية الحية.

التطورات الأخيرة في رواية ncAAs تتعلق الجانب سلسلة مجموعات كيميائية مناسبة للكيمياء بيورثوجونال خالية من محفز فائق السرعة قد فتحت إمكانية تثبيت fluorophores الجيل الأخير لتصوير فائقة القرار إلى البروتينات مباشرة على يعيش الخلايا2،43. وتشمل هذه المراسي الكيميائية سيكلوكتيني المتوترة في سكوك14، نونيني بيسيكلو [6.1.0] في12،بكنك17، وعبر-سيكلوكتينيس في تكلفة الامتلاك الكلية * ك13،،من1517 من بين ncAAs أخرى إيواء نوربورنيني16،17،44 أو سيكلوبروبيني45،46 moiety. NcAAs ضخمة للكيمياء بيورثوجونال مدرجة بالبديل من بيلرس وعادة ما تتم الإشارة إليها بيلرسAF (يشير إلى الطفرة Y271A و Y349F في بيلرس م. باركيري )، فضلا عن الأخرى المخصصة تطورت نكارس17 , 44-المراسي بيورثوجونال تتفاعل مع تيترازيني الكواشف47 عبر سيكلواديتيون ديلز-الدر معكوس إلكترون-الطلب إعطاء غلات التوسيم عالية ضمن بضع دقائق43،48. بيد قد تم الطعن في تطبيق هذا النهج قوية إلى التسمية جبكرس سبب منخفضة كفاءة الكلية للنظام نكا متعامد على إدراج. استخدام نظامنا برونتوسوروس المعززة، أظهرنا مؤخرا إدماج عالية الغلة من هذه الأحماض الأمينية في جبكرس وفائق السرعة هذه العملية وضع العلامات على سطح خلايا الثدييات يعيش30. مستقبلات المسمى كانت لا تزال وظيفية، كما أنها تستوعب الفيزيولوجية عند تنشيط المستقبلات مع مؤثر. المراسي البروتوكول التجريبي لإدراج بيورثوجونال في جبكرس والخطوات وضع العلامات التالية التي تم وصفها هنا. تجهيز جبكرس مع فلوروفوريس مشرق الصغيرة هو الخطوة الأساسية الأولى باتجاه دراسة ديناميات GPCR الهيكلية في الخلية الحية عبر تقنيات متقدمة في الفحص المجهري.

Protocol

1-الأسفار على أساس الفرز لإدماج الكفاءات (الشكل 1) الحفاظ على خلايا HEK293 في المتوسط “تعديل النسر” دولبيكو (دميم؛ الجلوكوز عالية، 4 مم الجلوتامين، بيروفات) وتستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% و…

Representative Results

الخطوط العريضة للمقايسة الأسفار هو مبين في الشكل 1. الإنزيم يعمل في ثلاثة طلبات. في المقام الأول، يتم فحص عدد من المتغيرات الحمض الريبي النووي النقال لإدماج Lys(Boc) بزوج متعامد برونتوسوروس. Lys(Boc) هو من الأحماض الأمينية ستيريكالي مماثلة إلى برونتوسوروس. برونت…

Discussion

ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة وموثوق بها تقييم الكفاءة لأزواج متعامد لإدماج ncAAs في البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب فيما يتعلق بالاختبارات المستخدمة على نطاق واسع يستند إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية هو أنه يسمح بإعداد المتزامنة وقياس لعدد أكب…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تأسيس هذا العمل قبل الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) ضمن المنح CO822/2-1 (برنامج إيمي نويثر) و CO822/3-1 إلى جيم

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging
check_url/57069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image