इमेजिंग मध्यवर्ती रेशा और Microtubules 2-आयामी प्रत्यक्ष Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी के साथ
Summary
इस पद्धति का समग्र लक्ष्य नमूना तैयारी से छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण के लिए इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों को देने के क्रम में 2d दोहरी रंग dSTORM छवियों microtubules और मध्यवर्ती तंतुओं की निश्चित कोशिकाओं में प्रदर्शन करने के लिए है
Abstract
cytoskeleton, actin microfilaments, microtubules, और मध्यवर्ती रेशा से बना (यदि), कोशिका आकार, ध्रुवीकरण, और गतिशीलता के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । actin और microtubule नेटवर्क के संगठन बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है लेकिन आईएफएस की है कि अभी तक पूरी तरह से नहीं विशेषता है । आईएफएस 10 एनएम के एक औसत व्यास है और एक नेटवर्क के रूप में सेल कोशिका द्रव्य भर में विस्तार । वे शारीरिक रूप से आणविक मोटर्स और cytoskeletal लिंकर्स के माध्यम से actin और microtubules के साथ जुड़े रहे हैं । इस तंग एसोसिएशन विनियामक तंत्र है कि तीन cytoskeletal सबसे सेल कार्यों के लिए आवश्यक नेटवर्क के समंवित विनियमन सुनिश्चित करने के दिल में है । यह इसलिए अकेले आईएफएस कल्पना महत्वपूर्ण है और यह भी एक साथ अंय cytoskeletal नेटवर्क के प्रत्येक के साथ । हालांकि, अगर नेटवर्क सबसे सेल प्रकार में अत्यंत घने हैं, विशेष रूप से glial कोशिकाओं में है, जो अपने संकल्प बहुत मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (~ 250 एनएम के पार्श्व संकल्प) के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । प्रत्यक्ष STochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM) परिमाण के एक आदेश के पार्श्व संकल्प में एक लाभ की अनुमति तकनीक है । यहां, हम है कि पार्श्व dSTORM संकल्प दिखाने के लिए अगर नेटवर्क के घने संगठन को हल करने के लिए पर्याप्त है और, विशेष रूप से, अगर microtubules आसपास के बंडलों । इस तरह के तंग एसोसिएशन के लिए इन दो नेटवर्क के समंवित विनियमन में भाग लेने की संभावना है और मई, कैसे vimentin IFs टेंपलेट और स्थिर microtubule संगठन के रूप में अच्छी तरह के रूप में microtubule निर्भर vesicular ्े प्रभाव सकता है समझाओ । अधिक आम तौर पर, हम बताएंगे कि कैसे दोहरे रंग dSTORM तकनीक के साथ दो cytoskeletal घटकों के अवलोकन उनके आपसी संपर्क में नई अंतर्दृष्टि लाता है ।
Introduction
Cytoplasmic मध्यवर्ती रेशा (आईएफएस) 10 एनएम व्यास होमो-या एक कोशिका प्रकार विशिष्ट सबसेट के heteropolymers अगर प्रोटीन हैं । आईएफएस ऐसे सेल गतिशीलता, प्रसार और तनाव प्रतिक्रियाओं के रूप में सेलुलर कार्यों की एक बड़ी रेंज में भाग लेते हैं । उनकी प्रमुख भूमिका तथ्य यह है कि 90 से अधिक मानव रोगों सीधे में उत्परिवर्तनों की वजह से कर रहे है पर प्रकाश डाला है अगर प्रोटीन; उदाहरण के लिए, यदि संरचना में परिवर्तन ट्यूमर विकास के साथ है और1,2,3फैल । वहां सबूत है कि तीन cytoskeleton प्रणालियों के सहयोग से इस तरह के सेल ध्रुवीकरण, विभाजन और प्रवासन2,3के रूप में सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करने के लिए काम बढ़ रहा है । के बाद से वहां स्थानिक वास्तुकला और कार्यों के बीच एक तंग युग्मन है, यह अंय तंतुओं के साथ अगर और बेहतर cytoskeletal पार बात समझ के संरचनात्मक संगठन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह आलेख सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक दोहरे रंग dSTORM (प्रत्यक्ष STochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी)4 को निष्पादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है और इसे यदि और microtubules के बीच बातचीत की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो cultureed 2 आयामों में कोशिकाओं (2d) ।
कई सुपर संकल्प तकनीक पिछले एक दशक से अधिक विकसित किया गया है, और वहां खोजों रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार के मूल में 2014 में थे5। इन सभी तकनीकों के बीच एकल अणु स्थानीयकरण-पाम6 (फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) जो photoswitchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन, fluorophores या dSTORM 4 के जोड़े के साथ7 तूफान का उपयोग करता है जैसे तरीकों आधारित है पारंपरिक fluorophores के साथ । इन सभी तरीकों को एक ही सिद्धांत है जो (i) एक “बंद” राज्य “(गैर फ्लोरोसेंट), (ii) में एक फ्लोरोसेंट राज्य में उनमें से एक सबसेट के stochastic सक्रियण के होते है के शामिल है पर आधारित है ताकि स्थानीयकरण के लिए उनके नैनोमीटर सटीकता के साथ स्थानिक स्थिति है, और (iii) इस प्रक्रिया के दोहराव के क्रम में संभव के रूप में fluorophores के कई सबसेट के रूप में सक्रिय करने के लिए । एक अंतिम छवि सक्रिय अणुओं के सभी स्थानीयकरण का उपयोग कर खंगाला है, एक पार्श्व संकल्प प्रदान करने के लिए नीचे ~ 20-40 एनएम । कई व्यावसायिक ऑप्टिकल पाम/तूफान की अनुमति प्रणाली नियमित प्रयोगों के लिए जीव के लिए अब उपलब्ध हैं । यहां, एक ऐसी प्रणाली microtubules और आईएफएस के संरचनात्मक संघ का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सभी एकल-अणु स्थानीयकरण-आधारित विधियों में, डुअल-कलर dSTORM तकनीक का चयन किया गया था, क्योंकि यह अनुयाई कोशिकाओं के बहुत पतले lamellar क्षेत्रों (< 1 µm) का निरीक्षण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और साथ में छवि रिज़ॉल्यूशन का महत्वपूर्ण सुधार प्रदान कर सकता है न्यूनतम समय और धन निवेश । दरअसल, dSTORM एक बहुत ही सुविधाजनक और बहुमुखी तकनीक है कि नियमित रूप से सेलुलर धुंधला और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इस्तेमाल किया मानक कार्बनिक रंजक के साथ संगत है ।
जबकि एक रंग dSTORM छवियों अपेक्षाकृत fluorophore Alexa647 का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं8, दोहरी रंग dSTORM प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुकूलन ताकि दो रंजक ठीक से चुना बफर में पलक कर सकते है की आवश्यकता है, खासकर जब वहां सीमित है लेजर शक्ति । उत्कृष्ट कागजात पहले से ही dSTORM9,10,11,12,13, और इन पत्रों के संभावित स्रोतों के विस्तार में समझाने के साथ बहु रंग इमेजिंग स्थापित करने के तरीकों पर उपलब्ध हैं कलाकृतियों और नीचा छवि संकल्प के साथ ही उन्हें दूर करने के लिए कैसे. इस अनुच्छेद में, कोशिकाओं निर्धारण, immunostaining, नमूना तैयारी, इमेजिंग अधिग्रहण और छवि पुनर्निर्माण के मामले में इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों में वर्णित है ताकि घने cytoplasmic की छवियां प्राप्त करने के लिए नेटवर्क और microtubules में दोहरी रंग dSTORM के साथ कोशिकाओं glial । संक्षेप में, निष्कर्षण/Chazeau एट अल12 में वर्णित विधि glial कोशिकाओं के लिए अनुकूलित और एक के बाद निर्धारण कदम, अनुकूलित एंटीबॉडी एकाग्रता, 10 मिमी मेे Dempsey9 एट अल में वर्णित के साथ एक तूफान बफर के साथ इस्तेमाल किया गया था । जो था प्रयोगात्मक सेट अप और नमूना प्रकार के लिए इष्टतम होना पाया ।
Glial कोशिकाओं को मुख्यतः यदि प्रोटीन के तीन प्रकार: vimentin, nestin और GFAP (Glial अंलीय fibrillary प्रोटीन) व्यक्त करते हैं । इन तीनों प्रोटीन्स को astrocytes14में सह-polymerize दिखाया गया । हम पहले सुपर संकल्प का उपयोग कर दिखाया दीप्ति माइक्रोस्कोपी (एसआर सिम) कि इन तीन अगर प्रोटीन एक ही एकल में पाया जा सकता है अगर रेशा और वे glial कोशिकाओं में इसी तरह के वितरण और गतिशीलता प्रदर्शन 15. तीन के बीच समानता के कारण अगर प्रोटीन, vimentin धुंधला पूरे अगर नेटवर्क के लिए एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । dSTORM का प्रयोग, हम कैसे अगर microtubules, जो विवर्तन सीमित माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ संभव नहीं था के साथ फार्म बंडलों को हल करने में कामयाब15। इन टिप्पणियों से यह समझने में मदद मिल सकती है कि vimentin IFs कैसे microtubules टेम्पलेट कर सकता है और उनके विकास पथ को विनियमित करता है, सेल माइग्रेशन के दौरान एक ध्रुवीय अक्ष के रखरखाव को बढ़ावा देता है16. सुपर संकल्प छवियों दो cytoskeletal उपतंत्रों के आपसी संपर्क के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की है, और स्थानिक एसोसिएशन और स्थानीय समारोह जो सेल प्रकार विशिष्ट हो सकता है के बीच कड़ी में अंतर्दृष्टि लाया17। सामान्य तौर पर दोहरे रंग के dSTORM का इस्तेमाल cytoskeletal तत्वों या अन्य प्रकार के organelles के बीच crosstalk का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है बशर्ते कि अच्छी immunostaining स्थितियाँ घनत्व और विशिष्टता की दृष्टि से पहुँची हों. इस तकनीक को बेहतर cytoskeleton परिवर्तन astrogliosis के दौरान और ग्लियोब्लास्टोमा, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के सबसे आम और सबसे घातक ट्यूमर है, जहां की अभिव्यक्ति अगर प्रोटीन 18 बदल गया है की विशेषता के लिए उपयोगी हो जाएगा ,19,20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण
हम यहां मौजूद एक प्रोटोकॉल जो glial कोशिकाओं में microtubules और आईएफएस की dSTORM छवियों में कलाकृतियों को कम करता है । कलाकृतियों नमूना तैयारी और इमेजिंग के हर कदम पर बन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Mickael Lelek, Orestis Faklaris और निकोलस Bourg के लिए उपयोगी चर्चा, एंड्री Aristov और ऐलेना Rensen के लिए सुपर संकल्प तकनीक और शैलजा सीतारमन के साथ मदद के लिए पांडुलिपि के सावधान पढ़ने के लिए धंयवाद । हम कृतज्ञता UtechS नैनोवायर इमेजिंग (Imagopole) Institut पाश्चर के Citech (पेरिस, फ्रांस) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फ्रांस-इमेजिंग बुनियादी ढांचा नेटवर्क फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-10-INSB-04 द्वारा समर्थित स्वीकार करते हैं; भविष्य के लिए निवेश), और Elyra माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए Région इले-डे-फ्रांस (प्रोग्राम domaine d’Intérêt Majeur-Malinf). यह काम Ligue Contre le कैंसर और फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-16-CE13-0019) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
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