Imaging промежуточных филаментов и микротрубочек с 2-мерной прямой стохастических оптических реконструкции микроскопия
Summary
Общая цель этой методологии является дать оптимальных экспериментальных условиях от Пробоподготовка для захвата изображений и восстановления для выполнения 2D двойной цвет изображения dSTORM микротрубочки и промежуточные филаменты в фиксированных ячейках
Abstract
Цитоскелет, состоящий из актина микрофиламенты, микротрубочки и промежуточные филаменты (КРП), играет ключевую роль в элементе управления формы клеток, полярности и подвижности. Организация сетей актина и микротрубочек широко изучены, но что IFs не еще характеризуется полностью. МФСМЦ имеют средний диаметр 10 Нм и формы сеть расширения всей цитоплазме клеток. Физически они связаны с актина и микротрубочек через молекулярные моторы и цитоскелета компоновщики. Этот плотный Ассоциация находится в центре регулирующих механизмов, обеспечивающих скоординированного регулирования трех цитоскелета сетей, необходимых для большинства функций клеток. Поэтому важно визуализировать IFs самостоятельно, а также совместно с каждой из других сетей, цитоскелета. Однако, если сети являются чрезвычайно плотной в большинстве типов клеток, особенно в глиальных клеток, что делает ее резолюции очень трудно достичь с стандартным флуоресцентной микроскопии (боковые резолюции ~ 250 Нм). Прямые стохастических оптической микроскопии реконструкции (dSTORM) — это метод, позволяя получить в боковых резолюции один порядок величины. Здесь мы показывают, что боковой dSTORM резолюции достаточно для устранения плотной Организации если сетей и, в частности, если пучки окружающих микротрубочек. Такая жесткая ассоциация может участвовать в координации регулирования этих двух сетей и Май, объяснить как виментин IFs шаблон и стабилизировать микротрубочек Организации, а также могут влиять микротрубочек зависимых везикулярного людьми. В целом мы покажем, как наблюдение за два цитоскелетных компонентов с двойной цвет dSTORM техника приносит новое понимание их взаимодействия.
Introduction
10 Нм диаметр гомо – или heteropolymers клетки типа определенное подмножество если белков цитоплазматического промежуточные филаменты (IFs). МФСМЦ участвовать в большой спектр клеточных функций, таких как клетки моторики, распространением и стресс ответы. Их ключевая роль выделяется тот факт, что более чем 90 заболеваний человека вызваны непосредственно мутации в если белки; например изменения в составе если сопровождает роста опухоли и распространение1,2,3. Существует растущий доказательства того, что три цитоскелета системы работают совместно для клеточных функций управления таких клеток поляризации, отдел и миграции2,3. Поскольку нет жесткой связи между функциями и пространственных архитектуры, важно получить понимание структурной организации, если с другими волокнами и лучше понять цитоскелета кросс talk. Эта статья предоставляет протокол для выполнения суперразрешением технику двойной цвет dSTORM (прямая стохастических оптической реконструкции микроскопии)4 и как она используется для изучения взаимодействия между если и микротрубочек в фиксированной, культивированный клетки в 2 размерах (2D).
Несколько методов супер резолюции были разработаны в последние десятилетия и там открытий были на происхождение Нобелевской премии по химии в 2014-5. Среди всех этих методов лежит методы, основанные на локализации одной молекулы, как PALM6 (Photo-Activated локализации микроскопии) который использует фотопереключаемых флуоресцентных белков,7 ШТОРМА с парами флуорофоров или dSTORM4 с обычными флуорофоров. Все эти методы основаны на тот же принцип, который состоит из (i переключатель большинства флуоресцентные репортеров в состояние «Выкл»» (non люминесцентные), (ii) стохастические активации подмножество их в люминесцентных государства для того, чтобы локализовать их пространственное положение с нанометровой точностью и (iii) повторение этого процесса с тем, чтобы активировать столько подмножеств флуорофоров как можно скорее. Окончательное изображение восстанавливается с помощью всех локализаций Активированные молекулы, обеспечивая латеральное разрешение до ~ 20-40 Нм. Несколько коммерциализированной оптических систем, позволяя PALM/шторм теперь доступны для биологов для обычных экспериментов. Здесь одна такая система была использована для изучения структурных ассоциации микротрубочек и IFs. Среди всех сингл молекула локализации на основе методов, был выбран метод двойной цвет dSTORM, потому что это хорошо подходит для наблюдать очень тонкий пластинчатый регионов (< 1 мкм) адэрентных клеток и может обеспечить значительное улучшение разрешения изображения с минимальные инвестиции времени и денег. Действительно dSTORM-это очень удобный и универсальный метод, который совместим с стандартной органические красители, обычно используются для пятнать клеточных и иммунофлюоресценции.
В то время как один цвет dSTORM изображения относительно просто можно получить с помощью Флюорофор Alexa6478, двойной цвет dSTORM требует, чтобы оптимизировать экспериментальных условиях, так что две краски может мигать правильно выбранного буфера, особенно когда есть ограниченное мощность лазера. Отличные документы уже доступны на методы для установки многоцветные изображения с dSTORM9,10,11,12,13, и эти документы подробно объяснить все возможные источники артефакты и деградированных изображения резолюции и как их преодолеть. В этой статье, оптимальные экспериментальных условий с точки зрения фиксации клетки, иммуноокрашивания, подготовка образца описаны изображений приобретение и реконструкции изображения для того чтобы получить изображения плотной цитоплазматической сети если и микротрубочек в Глиальные клетки с двойной цвет dSTORM. Кратко добыча/фиксации метода, описанного в Chazeau et al12 был адаптирован к глиальных клеток и используется с шагом после фиксации, оптимизированный антитела концентрации, шторм буфера с 10 мм МПС описаны в Демпси9 et al., который был установлено оптимальное для экспериментальной установки и образец типа.
Глиальные клетки главным образом выразить три типа если белков: виментин, Нестин и СВМС (глиальные кислой фибриллово белка). Эти три белки были показаны совместно полимеризоваться в астроциты14. Ранее мы показали, с помощью структурированных суперразрешением освещения микроскопии (SR SIM) что эти три если белки можно найти в же одной если нити накала и что они показывают аналогичные распределение и динамика в глиальных клеток 15. Из-за сходства между тремя если белки виментин пятнать был использован как репортер для всей сети если. С помощью dSTORM, нам удалось решить как если форма связок вдоль микротрубочек, которых не было возможности с дифракции ограниченный микроскопии методы15. Эти замечания могут помочь понять, как виментин IFs может шаблон микротрубочек и регулировать их траектории роста, содействия поддержанию полярности оси во время миграции клеток16. Супер-разрешением ключевую информацию о взаимодействия двух цитоскелета подсистем и принес понять связь между пространственной ассоциации и местные функции, которая может быть типа клеток конкретных17. В общем двухцветный dSTORM может использоваться для изучения перекрестных помех между цитоскелетных элементов или других видов органеллы, при том условии, что хорошо иммуноокрашивания условия достигаются с точки зрения плотности и специфичности. Этот метод будет полезным для лучше характеризуют изменения цитоскелета, наблюдаемые во время astrogliosis и глиобластома, наиболее распространенных и наиболее злокачественной опухоли центральной нервной системы, где это выражение IF белков изменены 18 ,19,,2021.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшие шаги в протоколе
Мы представляем здесь протокол, который минимизирует артефакты в образах dSTORM микротрубочки и IFs в глиальных клетках. Артефакты могут быть созданы на каждом этапе подготовки проб и изображений: фиксации, блокировки, immunolabeling, дрейф во вр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Mickael Лелек, Orestis Faklaris и Nicolas Бур для плодотворного обсуждения, Аристов Андрей и Елена голландской компании Rensen за помощь с суперразрешением техникой и Shailaja Сиитараман для внимательного прочтения рукописи. Мы с благодарностью признаем фотонные BioImaging UtechS (Imagopole) Citech Институт Пастера (Париж, Франция), а также сети инфраструктуры Франции-BioImaging, поддерживаемых Агентством исследований национального французского (АНР-10-INSB-04; Инвестиции в будущем) и округов Иль (программа Domaine d’Intérêt мажорных-Malinf) для использования в Микроскоп Elyra. Эта работа была поддержана Лига Contre le рака и французского национального исследования агентства (АНР-16-CE13-0019).
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
References
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Dempsey, G. T. A user’s guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
- Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
- Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
- Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
- Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
- Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
- Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
- Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
