Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein
Summary
Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.
Abstract
Identificatie van de natuurlijke liganden van chemoreceptors en structurele studies gericht op opheldering van de moleculaire basis van de specificiteit van het ligand kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van milligram bedragen van pure, gevouwen ligand bindende domeinen. Misbruik van geïnfecteerd express periplasmische ligand bindende domeinen van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) vaak resulteren in hun gericht op integratie-organen. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van opneming organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische dCACHE ligand bindend domein van Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. De aanpak omvat uitdrukking van de proteïne van belang met een cleavable zijn6-tag, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen, eiwit uiteinde door ureum uitputting en zuivering door middel van de chromatografie van de affiniteit, gevolgd door tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De circulair dichroïsme spectroscopie wordt gebruikt voor het bevestigen van de gevouwen staat voor het pure eiwit. Het is aangetoond dat dit protocol in het algemeen nuttig voor productie van milligram bedragen van dCACHE periplasmische ligand bindende domeinen van andere bacteriële chemoreceptors in de vorm van een oplosbare en crystallisable is.
Introduction
Chemotaxis en motiliteit is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de pathogenese van Campylobacter jejuni door bacteriële kolonisatie en invasie van de host1,2,3te bevorderen. Chemotaxis kan bacteriën toewerken naar een optimale omgeving voor de groei, als geleid door chemische signalen. Dit proces omvat erkenning van intracellulaire en milieu chemische signalen door een aantal eiwitten genoemd chemoreceptors of transducer-achtige eiwitten (Tlps). De meeste chemoreceptors zijn membraan-embedded eiwitten met een extracytoplasmic ligand bindend domein (LBD), een transmembraan domein en een cytoplasmatische seingeving domein, de laatste van die samenwerkt met de cytosolische signalering eiwitten die het signaal zenden motoren aan de flagellar4,5,6,7.
Elf verschillende chemoreceptors er zijn geïdentificeerd in de C. jejuni genoom4,8. Tot op heden, slechts enkele van deze chemoreceptors hebben gekenmerkt en de specificiteit van de ligand van Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, en Tlp11-13 is bekend. Identificatie van de natuurlijke liganden van de resterende chemoreceptors in deze soort, en talrijke chemoreceptors in andere bacteriën, kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van gevouwen en zeer zuiver recombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. uitspreken geïnfecteerd periplasmische LBDs van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli vaak resulteren in hun doelgerichtheid in de integratie-organen17,18,19 . Niettemin, dit fenomeen kan vergemakkelijken eenvoudig isolatie en herstel van het eiwit in de hand. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van integratie-organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische LBD van de C. jejuni chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. In het volgende voorbeeld werd gekozen omdat Tlp3-LBD behoort tot de dCACHE familie20 van teledetectie domeinen die overvloedig in tweecomponenten histidine kinases en chemoreceptors in prokaryoten20,21, gevonden zijn 22 , 23.
In deze benadering de constructie voor de expressie, op basis van een pET151/D-TOPO vector, is ontworpen om het nemen van een N-terminal zijn-6-label, gevolgd door een tabak etch virus (TEV) protease breukzijde, voor latere tag verwijdering19. Het protocol beschrijft eiwit overexpressie in E. coli, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen en eiwit uiteinde van ureum uitputting. Volgende uiteinde, het monster wordt gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit, met optionele tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De gevouwen staat van het gezuiverde eiwit wordt bevestigd met behulp van circulair dichroïsme spectroscopie. Dit is een gewijzigde versie van de methode die eerder is ontwikkeld om te herstellen en zuiveren van de LBD van een verschillende chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Deze procedure, samengevat in Figuur 1, levert 10-20 mg zuivere, niet-gecodeerde Tlp3-LBD per 1 liter van bacteriële cultuur, met een zuiverheid van de proteïnen van > 90% zoals geraamd door SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een eenvoudige procedure voor expressie en het uiteinde van de organen van de opneming van de periplasmatische LBD van de bacteriële chemoreceptor Tlp3 wordt gepresenteerd. Voorbereiding van het pure eiwit gaat om overmatige expressie van het huisdier-plasmide-gecodeerde gen in E. coli, zuivering en oplossen van integratie-organen, uiteinde van de gedenatureerde proteïne en haar zuivering door de opeenvolgende affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie stappen. De ureum-vergemakkelijkt denaturatie- en ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Yu C. Liu voor zijn vroege werk over de Tlp3-LBD productie. Mayra A. Machuca is dank verschuldigd aan Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS voor een doctoraal beurs.
Materials
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
- Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
- Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
- Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
- Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
- Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
- Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
- Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
- Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
- Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
- McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
- Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
- Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
- Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
- Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
- Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
- Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
- Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
- Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
- Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
- Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
- Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
- Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
- Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
- Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
- Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
- Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
- Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
- Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
- Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
- Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).
