人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離
Summary
ここで分離し、その表現型および機能特性評価のための人間の女性の生殖器官の別の解剖学的なコンパートメントから樹状細胞を浄化する手法について述べる。このメソッドは、他の免疫細胞やその他の粘膜組織から樹状細胞を分離する合わせることができます。
Abstract
ひと樹状細胞 (Dc) 粘膜組織における居住者の特性は、サンプルの取得の難しさのために挑戦し、組織あたりの Dc の低い数字を提示します。まだ、組織環境によって表現型と Dc の機能を変更すると、組織 DC 住民を分析、血が不完全な Dc を得られるので組織で DCs の複雑さを反映する必要は。人間女性の生殖器官 (FRT) 子宮摘出標本を用いた表現型および機能解析を可能にするから Dc を分離するためのプロトコルをご紹介します。プロトコルは、肯定的な磁気ビーズの選択に続いて、細胞懸濁液を混合、1 つのセルを生成する組織消化で構成されます。私たちの組織の消化力のプロトコルはない表面マーカーを切断一晩培養や細胞活性化せず、定常状態における DCs の表現型および機能分析が可能。このプロトコルは、他の免疫細胞の種類の分離または他の組織からの Dc の分離の合わせることができます。
Introduction
Frt 社は、着床と妊娠1しながら病原体からの保護のデュアル機能を有しています。これを達成するためには、ユニークな組織学的、免疫学的、および機能特性1を表示するそれぞれの解剖学的領域で、frt 社を区分します。
Dc の粘膜表面に存在する肺、腸、生殖管における微生物との接触し、潜在的な病原体2免疫監視を提供します。DCs は、首相のナイーブ T 細胞と免疫3をトリガーするユニークな能力を持っています。Frt 社の Dc も専門にする精子や胎児、妊娠の成功4を許可するなどの外国の抗原を容認します。そのため、場所によっては、DC の表現型と機能が、異なっています。それは彼らの数、表現型、および関数は、3存在する組織環境によって変更するよう Dc が組織環境によって強く影響を受けている知られています。したがって、FRT Dc は、感染症、妊娠、および、FRT でがんに果たす役割を理解し、居住者の Dc を派生の DC モデルが FRT 組織に規制の複雑さに対処する十分な血から、勉強する必要があります。
人間の組織の評価バイオハザード Dc 細胞粘膜組織中に存在数が少ないと人間の組織サンプルを入手できないのために困難です。Dc は、免疫組織化学5,を使用して6にして、組織内のセル位置について通知が機能研究を排除、細胞マーカー分析することができますを識別する数に制限は FRT で研究されています。一度に。また、フローサイトメトリーによる解析のための単一のセル隔離のプロトコル開発7,8,9をされています。これらのプロトコルの一部は移行これらのセルを隔離する Dc の渡り鳥の容量を活用します。これらのメソッドは、通常夜通し孵化し活性化された Dc の選択を必要とするが、定常状態における DCs の研究を可能にしません。
ここでは、子宮摘出標本を使用して、子宮内膜 (EM)、FRT で異なる解剖学的サイトから Dc を分離するためのプロトコルを最適化されたコルポ (CX) と、子宮頸膣部 (ECX)、表現型および機能解析を可能にします。非蛋白分解酵素の消化力のプロトコルを使用して、細胞の活性化せず細胞分離と流れフローサイトメトリー評価組織消化後すぐに進めることができます。フローサイトメトリー マルチ カラーを使用して、機能に関する細胞の低い数字を適応、我々 を識別でき、ビームステアの異なるサイトの Dc のまれなサブセットを特徴付ける
Protocol
Representative Results
Discussion
粘膜 Dc、組織3に入る彼らの表現型と機能が変更された組織の環境の影響を強く珍しいセル人口です。血が派生した Dc が非常に有用なモデル、完全に DC の個体数と組織での多様性を反映しません。そのため、粘膜 Dc のユニークな特性を理解する組織からの一次電池の分離が必要です。Frt 社の別の解剖学的サイトから Dc の分離では、DC 機能の in vitro研究し、DC サブセ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH がサポートした調査は、AI102838、AI117739 (CRW) を付与します。リチャード ・ Rossoll は、技術支援を感謝いたします。DartLab、Dartmouthsupported (P30CA023108 – 37) と (P30GM103415-15) で共有リソースのフローサイトメトリーによる解析を行った。
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
