Summary
Her beskriver vi en metode for å isolere og rense dendrittiske celler fra ulike anatomiske rom i den menneskelige kvinnelige skjede for vurdering av deres phenotypical og funksjonelle egenskaper. Denne metoden kan tilpasses å isolere andre immunceller eller dendrittiske celler fra andre mucosal vev.
Abstract
Karakterisering av de menneskelige dendrittiske cellene (DCs) bosatt i slimhinnene vev er utfordrende på grunn av vanskelighetene med å få prøver det lave antallet DCs presentere per vev. Likevel, som fenotypen og funksjon av DCs endres av vev miljøet, er det nødvendig å analysere vev bosatt DC befolkninger, siden blod avledet DCs ufullstendig reflekterer kompleksiteten i DCs i vev. Her presenterer vi en protokoll for å isolere DCs fra den menneskelige kvinnelige skjede (FRT) bruker hysterektomi prøver som gjør at både phenotypical og funksjonell analyser. Protokollen består av vev fordøyelsen å generere en enkeltcelle mikset celle suspensjon, etterfulgt av positiv magnetiske perlen valg. Vårt vev fordøyelsen protokollen ikke cleave overflate markører, som lar phenotypical og funksjonell analyse av DCs i steady state, uten overnatting inkubasjon eller celle aktivering. Denne protokollen kan tilpasses for isolering av andre immun celletyper eller isolering av DCs fra andre vev.
Introduction
FRT har dobbelt funksjonen beskytter mot patogener mens implantasjon og graviditet1. Dette compartmentalized FRT, med hver anatomiske region viser unike histologiske, immunologiske og funksjonelle egenskaper1.
DCs tilstede på slimhinnene overflater gjøre kontakt med mikrober i lungene, tarmen og genital tract og gi immun overvåking for potensielle patogener2. DCs har unike prime naiv T-celler og utløse adaptive immunreaksjoner3. DCs i FRT er også spesialiserte for å tolerere utenlandske antigener, som finnes i sæden og fosteret, slik at vellykket graviditet4. Derfor av blir DC fenotypen og funksjonen tydelig. Det er kjent at DCs er sterkt påvirket av vev miljø, slik at deres tall, fenotype og funksjoner er endret av vev miljøet der de bor3. Derfor, for å forstå rollen som FRT DCs spille i infeksjonssykdommer, graviditet og kreft i FRT, bosatt DCs må studeres, siden blod avledede DC modeller er utilstrekkelig til å adressere regulatoriske kompleksiteten i FRT vev.
Karakterisering av menneskelig vev bosatt DCs er utfordrende på grunn av det lave antallet celler i slimhinnene vev og problemer med å skaffe menneskelige vevsprøver. DCs har vært studert i FRT bruker immunohistochemistry5,6, som informerer om celleplassering i vevet, men utelukker funksjonelle studier, og er begrenset i antall identifisere cellen indikatorer som kan analyseres samtidig. Videre har enkeltcelle isolasjon protokoller for flyt cytometric analyse vært utviklet7,8,9. Noen av disse protokollene utnytte vandrende kapasiteten til DCs isolere celler som overfører. Disse metodene vanligvis krever overnatting incubations og utvalg av aktivert DCs, men tillater ikke for studiet av DCs i steady state.
Her bruker hysterektomi prøver, vi optimalisert en protokoll for å isolere DCs fra ulike anatomiske steder i FRT, endometrium (EM), i livmorhalsen (CX) og ectocervix (ECX), som gjør at både phenotypical og funksjonell analyser. Bruker en ikke-proteolytisk enzymatisk fordøyelsen protokoll, kan vi fortsette umiddelbart etter vev fordøyelsen til celle isolasjon og flow cytometric karakterisering uten celle aktivering. Bruker multicolor flowcytometri og tilpasse funksjonelle studier for lavt antall celler, kan vi identifisere og karakterisere sjeldne delsett av DCs i de ulike nettstedene i FRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier som involverer mennesker ble gjennomført i henhold til prinsippene i deklarasjonen i Helsinki. Studier ble godkjent av Dartmouth College institusjonelle Review Board og komiteen for beskyttelse av menneskelig fag (CPHS). Skriftlig samtykke ble innhentet før operasjonen fra HIV-negativ kvinner under hysterectomies ved Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Libanon, NH). Utdannet patologer valgt vevsprøver fra EM, CX og ECX, gratis patologisk lesjoner og fjernt fra nettstedene til patologi. Blodprøver ble innhentet fra frivillige friske blodgivere rekruttert ved Dartmouth Hitchcock Medical Center. Blodgivere ble anonym. Fersk isolert EM og CX ECX vev fra operasjonssalen ble overført til patologi for isolasjon og klassifisering før overføre til vårt laboratorium i separate, sterile polypropylen rør.
1. enzymatisk fordøyelsen av vev
Merk: Bruk sterilt materialer og innarbeide en biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
- Forberede en modifisert Hanks balansert Salt løsning (HBSS) med 1 x HBSS med fenol røde, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0,35 finans NaHCO3og 20 mM HEPES.
- Forbered den enzymatiske cocktailen (modifisert HBSS, 450 U/mL collagenase IV, 0,01% [wt/vol] deoxyribonuclease jeg, og 2 mg/mL D-glukose). Løsningen passere et sterilt 0.22 µm filter. Ideelt sett forberede fordøyelsen enzymet ved bruk, men det kan være frosset om 20 ° C for lagring. Unngå gjentatt frysing og tining sykluser.
- Skyll vevet med modifisert HBSS og sted i en 100 x 15 mm2 Petriskål. Justere Petriskål størrelsen basert på mengden vev tilgjengelig og volumet av enzymet cocktail brukes (se trinn 1.4.2 nedenfor).
Merk: Vev varierer i størrelse avhengig av kirurgiske prøven fra patologi, fra 1-10 g. - Fysisk behandling med disponibel skalpell og tang:
- Legge til ca 3 mL oversikten enzym cocktail vev for å hindre tørking under sagingen.
- Bruk tang til å stabilisere vevet og hakke med skalpell øke arealet av vev utsatt for fordøyelsen enzymet cocktail. Skjær vevet i små biter (< 2 mm på en side). Legg nok oversikten enzym cocktail å dekke alle vev brikker (5 mL/g av vev). Plass lokket på Petriskål.
- Ruge på 37 ° C med 5% CO2 på en rotator på ca 80 rpm for 45 min. sikre at rotator hastigheten grundig blander oversikten enzym cocktail uten søl eller produserer bobler.
- Visualisere vev utarbeidelse med en invertert lys mikroskop med 4 X og 10 X mål.
Merk: Etter fordøyelsen, liten vev fragmenter og en mikset-celle suspensjon inkludert synlig epithelial kjertler som skal vises (se figur 1A).
2. fysisk separasjon av enkeltceller
- I et sterilt miljø, Plasser en stram 250 µm mesh med holder i en 150 x 15 mm2 Petriskål. Kontroller at maskene er ca 0,5 cm over vannflaten Petriskål.
- Våt mesh med 2 mL modifisert HBSS og overføre fordøyd vev på nettet.
- Bruker flate overflaten av en 10-mL sprøytestempelet, forsiktig men bestemt, grind fordøyd hakket vevet gjennom nettet.
Forsiktig: Sliping aggressivt vil skade mesh og øke celle dødelighet. Dette trinnet vil skille de epitelceller og stromal (inkludert immunceller) fra bindevev og slim. - Når vev fragmenter har blitt grundig spredt, heve mesh og holder 2-3 cm over Petriskål og skyll med 3 mL endret HBSS gjenopprette flere celler.
- Samle celle suspensjon. Plass 20 µm mesh med holder i en Petriskål og våt med 2 mL modifisert HBSS. Helle celle suspensjon gjennom maskene holder mesh 2-3 cm over Petriskål, og skyll med 6 mL av modifisert HBSS.
Merk: Dette trinnet vil skille epithelial ark, som beholdes på toppen, fra enkeltceller som passerer gjennom nettet. Gjennomflytsenhet er en mikset-celle suspensjon som inkluderer immunceller og stromal fibroblaster. - Samle mikset-celle suspensjon og sentrifuge 500 x g for 10 min. leveringstanken væsken og resuspend pellet i 4 mL av endrede HBSS for tetthet gradert sentrifugering.
- Lag mikset-celle suspensjon over 3 mL polysucrose løsning og sentrifuger ved romtemperatur på 500 x g i 30 min med ingen brems. Hente de hvit fra toppen av den polysucrose løsningen og vaskes med PBS.
Merk: Denne fraksjonen er beriket mikset-celle suspensjon, som er rik på immunceller og inneholder noen stromal fibroblaster.
3. døde fjerne
Merk: Hvis en stor andel av døde celler (> 20%) finnes i beriket mikset-celle suspensjon etter tetthet gradert sentrifugering, anbefales døde fjerne med magnetiske perler. Døde celler må fjernes siden de kan forstyrre positiv magnetiske perle utvelgelsesprosessen.
- Telle celler med en hemocytometer på et lys mikroskop med 10 X formål. Nedspinning alle cellene i beriket mikset-celle suspensjon (500 x g, 10 min, 4 ° C). Helt Sug opp og kast nedbryting. Legg 100 µL av død celle fjerning perler per 1 x 107 totalt celler (levende og døde), i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Plassere et 30 µm filter på kolonnen magnetisk, bruke celle suspensjon og at perle-merket cellene faller gjennom magnetiske kolonnen.
- Skyll kolonnen med døde celle fjerning bufferen som anbefalte (3 mL). Samle gjennomflytsenhet inneholder live cellene. Utvalget av celle utvinning etter døde fjerne vises i figur 1B.
Merk: Disse cellene kan brukes til å utføre flowcytometri flekker for phenotypical studier (del 5) og fortsett med fm isolasjon (del 4).
4. DC rensing av positiv magnetiske perle utvalg
- Følgende død celle fjerning (trinn 3.2), Nedspinning cellene, fjerne nedbryting og resuspend celle pellet 80 µL magnetiske utvalg buffer per 1 x 107 celler (PBS, 0,5% inaktivert humant AB serum (HS), 2 mM EDTA).
- For positive utvalg av DC befolkninger, legge CD1a eller CD14 magnetiske perler i henhold til produsentens instruksjoner (20 µL magnetiske perler per 1 x 107 celler). Inkuber i 15 min på 4° C.
- Vask cellene med magnetiske utvalg bufferen, spinne ned og fjerne buffer helt. Resuspend cellene i minst 500 µL magnetiske utvalg bufferen.
- Legge kolonnen til magneten og legge et 30 µm filter på kolonnen beholde eventuelle gjenværende celle klumper. Skyll filter- og kolonneinnstillingene med magnetiske utvalg buffer som anbefalt.
- Gjelde kolonnen cellen suspensjon. Skyll 3 ganger med magnetiske utvalg buffer.
- Overføre kolonnen til en 15-mL tube, legge til 5 mL magnetiske utvalg bufferen og bruke stempelet for å slippe de merkede cellene fra kolonnen.
- For å øke renhet, Gjenta trinn 4.4-4.6 med de gjenopprettede cellene ved hjelp av en ny kolonne. Utvalget av celle utvinning etter magnetiske perlen valg vises i figur 1 c.
5. vurdering av cellen renhet: Flow cytometri og mikroskopi
- Antistoff flekker for flowcytometri:
- Resuspend til 1 x 106 celler i 100 µL av PBS inneholder 20% inaktivert HS blokkere Fc reseptorer, og ruge i 10 min på is.
- Legge til ønsket fluorescently merket antistoffer og reagens for identifikasjon av døde celler (et eksempel, se avsnitt 6.5). Angi fluorescens minus én (FMO) kontroller etablere portene, og bruke kompensasjon perler for å forberede enkelt flekken kontroller for kompensasjon. Eksempler på antistoffer brukes er gitt i tabell 1. Inkuber etter 20 min på 4 ° C, beskyttet mot lyset.
- Vask cellene med 2 mL magnetiske utvalg buffer.
Merk: Tilstedeværelsen av EDTA er viktig å unngå dannelse av celle clumping for flyt cytometric analyse. Nedspinning og kast nedbryting. - Fastsette cellene ved å legge til 100 µL av 2% paraformaldehyde løsning per rør.
- Analysere eksemplene i ved en flyt cytometer10,11.
- Spinn kolonnen (f.eks, cytospin) og bruke Giemsa flekker for å analysere morfologi:
- Resuspend cellene i 200 µL magnetiske utvalg bufferen.
- Laste inn i en spinn kolonne og spinn for 5 min. La lysbildet tørke helt.
- Fastsette lysbildet ved neddykkelse i 100% metanol for 2 min. skyll lysbildet med deionisert vann og la den til luften tørr.
- Utføre en standard Wrights-Giemsa flekker. Dekke cellene med Eosin og ruge i 10 minutter, skyll med deionisert vann og la det tørke. Dekke cellene med Wrights-Geimsa flekken, ruge for 1 min, skyll med deionisert vann og lufttørke.
- Undersøke forberedelsene med en invertert mikroskopet (figur 2A, 40 X-målet).
6. allogene stimulering analysen å vurdere DC celle funksjon
- Tine frossen perifert blod mononukleære celler (PBMCs)
- Varme celle kultur media med 10% HS til 37 ° C.
- Tine i PBMCs ved å plassere cryotube i et 37 ° C vannbad, til litt frossen cellen media forblir i cryotube. I et sterilt miljø, overføre innholdet i cryotube til 10 mL forvarmes celle kultur medier med 10% HS i en 15-mL tube.
- Sentrifuge på ~ 500 x g for 7 min. fjerne media, spre pellet, resuspend PBMCs i 10 mL av celle kultur medier med 10% HS og sentrifuger cellene.
- Gjenta wash trinn en tredje gang. Telle celler.
- Naïve T-celle utvalg:
- Bruk en negativ utvalg magnetiske antistoff celle utvalg kit for å isolere naiv T-celler i henhold til produsentens protokollen.
- Etter isolasjon, sjekk renheten bruker CD45RA og CCR7 antistoffer.
Merk: Typisk renhet er > 99% naiv T-celler.
- Naïve T-celle spredning fargestoffet flekker:
- Forberede 600 µL av 2 x løsning celle spredning fargestoff, beskytte fargestoff fra lyseksponering.
- Vask naivt T-celler 2 x med PBS. Resuspend celler i 500 µL PBS.
- Mens forsiktig vortexing cellene i biosikkerhet skap, legge til 500 µL spredning fargestoff naive T-celler.
- Inkuber celler for 10 min på 37° C.
- Stoppe celle merkingen ved å legge til 5 mL av celle kultur medier med 10% HS til cellene. Ruge på is 5 min, beskyttet mot lyset.
- Sentrifuge cellene på ~ 500 x g i 7 min, Sug opp media, og resuspend cellene i 4 ° C celle kultur medier med 10% HS. Gjenta to ganger for totalt 3 vasker. Ta en aliquot av celler som skal telles før den siste sentrifugering.
Merk: Vanligvis siste naiv T-cellen tallene vil variere mellom 5% og 15% av den første PBMC-celletall. - Resuspend cellene med celle kultur media med 10% HS på ønsket celle konsentrasjonen.
- DC-allogene naiv T-celle co kultur:
- Plate isolert DCs og naiv T-celler i en 96-brønnen, runde-bunn plate, på en 1:15 forholdet mellom DCs til T-celler. Kontroller at optimal nummeret for DCs varierer mellom 3000 og 5000 celler/godt.
- Sentrifuge platen ved ~ 500 x g for 3 min å sikre cellene ligger i sentrum av brønnen. Celle-til-celle er viktig for riktig signalering oppstår.
- Ruge på 37 ° C for 6 dager. Overvåke klyngen av celler som vises i brønnene som spredning skjer, med mikroskopi (figur 3A).
- Flow cytometri flekker for å vurdere spredning:
- Etter 6 dager, kan celler undersøkes av flowcytometri. Stain co kultur for flowcytometri.
- Forberede en 2 x løsning av gule levedyktighet fargestoff (maksimal emission 572 nm) i PBS.
Merk: Bruk av PBS uten serum er viktig, som serum proteiner forstyrre fargestoff). - Sentrifuge platen med cellene på ~ 500 x g i 5 min.
- Fjerne 100 µL av nedbryting.
Merk: på dette punktet samle og lagre nedbryting for egen analyse av løselig faktorer. - Vask cellene to ganger med PBS: legge til 150 µL/godt av PBS, sentrifuge på ~ 500 x g i 5 min, fjerne 150 µL av nedbryting med en pipette. Kontroller at det er 50 µL av nedbryting igjen i hver brønn.
- Legge til 50 µL 2 x levedyktighet fargestoff i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur for 10 min, beskyttet mot lyset.
- Under incubation, Forbered en master blanding av ønsket antistoff markører. For eksempel: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, osv.
- Legg antistoff blandingen i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur for 10 min, beskyttet mot lyset.
- Vask cellene 2 x med PBS + 2% HS: legge til 150 µL/vel PBS + 2% HS. Sentrifuge på ~ 500 x g for 5 min. fjerne 150 µL av nedbryting med en pipette.
- Fastsette cellene ved å legge til 100 µL/vel av 2% para-formaldehyd. Hvis nødvendig: overføre celler og media til polypropylen flyt cytometri rør. Rør kan holdes på 4 ° C og beskyttet mot lyset, inntil flyt cytometric analysen.
- Les rør i en flyt cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende vev fordøyelsen, utgivelsen av epitelial ark og kjertler kan observeres, som vist i figur 1A; Dette er en positiv kontroll som angir enzymatisk fordøyelsen var vellykket. Antall totalt levedyktige cellers og DCs gjenopprettet pr. gram av vev er også vist i figur 1B og figur 1 c, henholdsvis. Immunceller representerer mellom 5-30% av stromal cellene før tetthet sentrifugering12,13. Figur 2 viser morfologi (figur 2A) og renhet (figur 2B, C) av isolerte domenekontrollere. Når to rundene utvalg utføres som angitt i protokollen, varierer forventet renheten mellom 85-92% (figur 2C). Antall gjenopprettede celler er variabel og avhenger første vev størrelse og donor variasjon. Karakteristikk av isolerte cellene har vært beskrevet13. Figur 3 viser en representant allogene stimulering analysen å vurdere DC funksjonalitet. Figur 3A viser karakteristiske T-celle klumper som vises når spredning oppstår, og figur 3B viser spredning kvantifisering av flowcytometri. Andre funksjonelle analyser, for eksempel viral fange eller cytokin og chemokine kan også være utført13. Figur 4 viser gating strategien for å identifisere forskjellige DCs befolkningene i forskjellige FRT anatomiske seksjonene etter flyt-cytometric analyse av beriket mikset-celle suspensjoner (figur 4A). Serine antistoffer og negative kontroller er viktig, DCs og makrofager vise høy autofluorescence. FMO kontroller vises i figur 4B. Figur 4C viser eksempler på hvordan å identifisere bestemte DC delsettene, som CD1c +, CD207 + eller CD103 + DCs.
Figur 1: vev behandling og celle tilgjengelighet. (A) representativt bilde av epitelial ark og kjertler utgitt etter vev fordøyelsen. (B) rekke antall levedyktige cellers utvinnes etter vev behandling og død fjerne i hver FRT avdeling: endometrium (EM), livmorhalsen (CX) og ectocervix (ECX). Hvert punkt representerer celler fra et annet emne. (C) nummeret av DCs utvinnes per gram vev etter magnetiske perle isolasjon. B og C er tilpasset fra13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: morfologi og renhet av isolerte cellene. (A) dendrittiske morfologi av isolerte cellene etter mikroskopi etter Giemsa flekker. (B) uttrykk for fenotypiske før og etter perle isolasjon, som bestemmes av flowcytometri. (C) representant renhet innhentet etter CD1a + og CD14 + perle isolasjon. Tilpasset fra13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: spredning analysen. (A) representant mikroskopi bilder av T-celle klynge formasjon under spredning: fase kontrast (venstre), spredning farge flekker (midten) og overlegg (høyre). (B) representativt eksempel på induksjon av spredning etter co kultur isolert endometrial CD1a + eller CD14 + DCs og allogene naiv T-celler Hentet fra frosne PBMCs. B er tilpasset fra13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Phenotypical karakteristikk av DCs i den beriket blandet celle suspensjon fra FRT. (A) Gating strategi for identifikasjon av domenekontrollere i blandede celle suspensjon. Hver gated befolkningen multicolor tomter vises i neste panelet. Kontur tomter viser CD11c + CD11b + og CD11c + CD11b-porter, henholdsvis. Markører som identifiserer uønsket celler kan være farget bruker samme kanal for å ekskludere dem fra analysen; for eksempel døde celler, CD3 + og CD19 + celler. (B) FMO kontroller å etablere riktige portene. (C) diskriminering av DC undergrupper etter gating strategien. Kontur tomter ble valgt i stedet for multicolor tomter til å mer nøyaktig representere befolkningen fordelingen når cellen tallene var lave10. Lav cellen tallene forventes på slutten av gating strategien, som vev DCs er sjeldne populasjoner. Tilpasset fra13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cellen markør | Fluorochrome | Klone | Konsentrasjon | Mengden av antistoff per prøve |
| (i 100 µl av buffer) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1.0 µg/5µl | 0,4 µg |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1.0 µg/5µl | 0,4 µg |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | 0,25 µg/5µl | 0,1 µg |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82,5 µg/ml | 0,16 µg |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 µg/ml | 0,03 µg |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 µg/ml | 0,27 µg |
| CD163 | APC | GHI/61 | 80 µg/ml | 0,16 µg |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CD1a | FITC | HI149 | 0,5 µg/5µl | 0,2 µg |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0,5 mg/ml | 1.0 µg |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0,25 µg/5µl | 0,1 µg |
| CD83 | PE | HB15e | 0,25 µg/5µl | 0,1 µg |
| CD14 | APC-brann | 63D 3 | 400 µg/ml | 0,8 µg |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1,25 µg/0,25 ml | 0,01 µg |
| Zombie gule levedyktighet fargestoff | ||||
| 7AAD | 0,1 mg/ml | 0.2ug |
Tabell 1: Eksempel på antistoffer for karakterisering av DCs i FRT av flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slimhinnene DCs er en sjelden celle befolkning sterkt påvirket av vev miljøet, som endrer deres fenotypen og funksjon når de skriver vev3. Mens blod avledet DCs er en meget nyttig modell, de representerer ikke fullt mangfoldet av DC bestander funnet i vev. Derfor, for å forstå de unike egenskapene til mucosal DCs, isolering av primære celler fra vev er nødvendig. Isolering av DCs fra ulike anatomiske steder i FRT tilbyr muligheten til å studere DC funksjon i vitro og sammenligne mellom DC delsett og anatomisk steder.
Her gir vi en protokoll som tillater rensing av DCs fra menneskelig FRT vev i vitro vurdering av funksjonelle egenskaper. Siden domenekontrollere finnes på slimhinnene steder i lave tall, utviklet vi en protokoll for å berike vev celle utarbeidelse av tetthet gradert sentrifugering og død fjerne før cellen aisolering med magnetiske perler. Korrekt fjerning av døde celler er nøkkelen, som de vil forstyrre perle isolasjon. Denne teknikken gir høy renhetsgrad positivt isolert celler (≈ 90%), i en relativt kort tidsperiode (4-6 h), og uten behov for overnatting inkubering, i vitro cellekultur eller overføring før isolasjon, hvorav hver kan aktivere DCs og endre karakteristikkene fenotypiske. Våre protokollen utløser ikke celle aktivering, målt ved mangel på opp-regulering av modning markører (CD86, HLA-DR, CD83)13. En annen fordel er bruken av en ikke-proteolytisk enzymatisk fordøyelsen, som ikke cleave overflate markører og gir umiddelbar cellen aisolering eller phenotypical analyse etter vev fordøyelsen14.
Kritisk til denne protokollen er generasjon av en enkelt celle suspensjon å unngå blokkeringen av magnetiske kolonnene. For å sikre dette, døde celler må fjernes før magnetiske celleutvalget, filtre måtte brukes på magnetiske kolonnene, og vev som er større enn 3 g bør deles mellom to kolonner. Bruk av en andre kolonne etter først runden av rensing er nøkkelen til høyt renhet.
En begrensning av metoden isolasjon er iboende lavt antall DCs i FRT vev, som vanligvis ikke tillater god celle utvinning av vev mindre enn 1 g. Under disse omstendigheter, men utføres phenotypical analyser fremdeles med den beriket mikset celle suspensjon. Dette er mulig på grunn av ikke-proteolytisk fordøyelsen metoden brukes, som ikke cleave overflate markører og tillater for umiddelbar analyse av cellen fenotypen etter vev fordøyelsen14. I tillegg kan til pasientens alder være en faktor som påvirker antall celler utvinnes.
Bruker denne protokollen, har vi tidligere vist at CD1a + isolasjon gir en svært mer homogen befolkningen enn CD14 + utvalg13; CD1a + DCs er imidlertid vanskelig å gjenopprette fra CX og ECX. Mens CD14 kan også uttrykkes på makrofager, fant vi at det FRT CD14 + isolert befolkningen er rik på DCs, basert på co uttrykk for DC markører og deres evne til å stimulere allogene naiv T-celler, som er kjennemerket funksjon DCs13.
Siden DCs gjenopprettet er generelt lavt (< 100 000 totalt celler), funksjonelle studier må være optimalisert for lav cellen tallene. Her viser vi optimalisering av allogene stimulering analysen, som kan utføres med kun 3000 DCs/godt. Vi har gjennomført andre funksjon studier med disse cellene, hormonelle responsen og cytokin antimikrobielle peptid produksjon ved HIV-stimulering og HIV-fangst av FRT DCs13. Når DCs er isolert og belagt, bør analyser utføres innen 24 timer, som cellen levedyktighet synker etter dette tidspunktet.
Denne protokollen kan tilpasses å isolere annerledes DC delsett eller andre celletyper ved å velge riktig markører kombinert magnetiske perler og kombinere sekvensiell positive og negative perle utvalg å fjerne uønsket celletyper. En forsiktig, skjønt, er at med hver runde utvalg noen prosent av cellene vil gå tapt, så for isolering av FRT DCs, som er allerede sjeldne og vev er vanligvis små, flere runder med utvalg med forskjellige indikatorer (og nødvendige vasker forbundet) er ikke ønskelig. Dessuten, denne protokollen kan tilpasses for å isolere andre immunceller eller DCs andre vev14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Studien støttes av NIH gir AI102838 og AI117739 (CRW). Vi takker Richard Rossoll for teknisk assistanse. Flyt cytometric analyse ble gjennomført i DartLab, den delte ressursen på Dartmouthsupported av (P30CA023108-37) og (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
