Phenotypical और कार्यात्मक अध्ययन के लिए मानव महिला प्रजनन पथ से वृक्ष कोशिकाओं का अलगाव
Summary
हम यहां एक विधि का वर्णन करने के लिए अलग और अपने phenotypical और कार्यात्मक विशेषताओं के मूल्यांकन के लिए मानव महिला प्रजनन पथ में विभिंन संरचनात्मक डिब्बों से वृक्ष कोशिकाओं को शुद्ध । इस विधि अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या अंय श्लैष्मिक ऊतकों से वृक्ष कोशिकाओं ।
Abstract
श्लैष्मिक ऊतकों में निवासी मानव वृक्ष कोशिकाओं (dc) के लक्षण वर्णन नमूनों को प्राप्त करने में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण है, और प्रति ऊतक वर्तमान dc की कम संख्या । फिर भी, के रूप में phenotype और dc के कार्य ऊतक पर्यावरण द्वारा संशोधित किया गया है, यह ऊतक निवासी डीसी आबादी का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है, के बाद से रक्त व्युत्पंन dc पूरी तरह से ऊतकों में dc की जटिलताओं को प्रतिबिंबित । यहाँ हम मानव महिला प्रजनन पथ (FRT) से dc को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद गर्भाशय नमूनों कि दोनों phenotypical और कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है का उपयोग कर. प्रोटोकॉल ऊतक पाचन के होते है एक एकल कोशिका मिश्रित सेल निलंबन, सकारात्मक चुंबकीय मनका चयन के बाद उत्पंन करते हैं । हमारे ऊतक पाचन प्रोटोकॉल सतह मार्करों, जो phenotypical और स्थिर राज्य में dc के कार्यात्मक विश्लेषण रातोंरात मशीन या सेल सक्रियण के बिना अनुमति देता है नहीं सट । इस प्रोटोकॉल अंय प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार या अंय ऊतकों से dc के अलगाव के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
FRT प्रत्यारोपण और1गर्भावस्था की अनुमति जबकि रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा के दोहरे समारोह है । यह पूरा करने के लिए, FRT compartmentalized है, प्रत्येक संरचनात्मक क्षेत्र के साथ अद्वितीय ऊतकवैज्ञानिक, प्रतिरक्षा, और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करने के लिए1।
श्लैष्मिक पर मौजूद dc फेफड़ों में रोगाणुओं के साथ संपर्क बनाने, आंत, और जननांग पथ, और संभावित रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा निगरानी प्रदान करते हैं2. dc प्रधानमंत्री भोली टी कोशिकाओं के लिए अद्वितीय क्षमता है और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर3. FRT में dc भी ऐसे शुक्राणु में पाया और विकासशील भ्रूण के रूप में विदेशी एंटीजन, बर्दाश्त करने के लिए विशेष कर रहे हैं, सफल गर्भावस्था की अनुमति के लिए4। इसलिए, स्थान के आधार पर, DC phenotype और फ़ंक्शन अलग हो जाएगा । यह ज्ञात है कि इस तरह की है कि उनकी संख्या, phenotype, और कार्यों ऊतक पर्यावरण जिसमें वे3रहते द्वारा संशोधित कर रहे है dc जोरदार ऊतक वातावरण से प्रभावित हैं । इसलिए, FRT dc FRT में संक्रामक रोगों, गर्भावस्था और कैंसर में खेलने की भूमिका को समझने के लिए, निवासी dc का अध्ययन करने की आवश्यकता है, क्योंकि रक्त व्युत्पंन डीसी मॉडल FRT ऊतकों में पाया विनियामक जटिलताओं को संबोधित करने के लिए अपर्याप्त हैं ।
मानव ऊतक निवासी dc के लक्षण वर्णन श्लैष्मिक ऊतकों में मौजूद कोशिकाओं की कम संख्या और मानव ऊतक नमूने प्राप्त करने में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण है । dc immunohistochemistry5,6, जो ऊतक के भीतर कोशिका स्थान के बारे में जानकारी का उपयोग कर FRT में अध्ययन किया गया है, लेकिन precludes कार्यात्मक अध्ययन, और सेल मार्करों कि विश्लेषण किया जा सकता की पहचान की संख्या में सीमित है एक बार में । इसके अलावा, फ्लो cytometric विश्लेषण के लिए एकल सेल अलगाव प्रोटोकॉल7,8,9विकसित किया गया है । इन प्रोटोकॉल में से कुछ को माइग्रेट करने वाले उन कक्षों को अलग करने के लिए dc की प्रवासी क्षमता का लाभ उठाते हैं । इन पद्धतियों आमतौर पर रातोंरात गर्मी और सक्रिय dc के चयन की आवश्यकता है, लेकिन स्थिर राज्य में dc के अध्ययन के लिए अनुमति नहीं है ।
यहां, गर्भाशय नमूनों का उपयोग कर, हम FRT में विभिंन संरचनात्मक साइटों से dc अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित, अंतर्गर्भाशयकला (EM), endocervix (CX), और ectocervix (ECX), कि दोनों phenotypical और कार्यात्मक विश्लेषण सक्षम बनाता है । एक गैर proteolytic एंजाइमी पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम तुरंत ऊतक पाचन कोशिका अलगाव और प्रवाह कोशिका सक्रियण के बिना cytometric लक्षण वर्णन के बाद आगे बढ़ सकते हैं । बहुरंगा प्रवाह cytometry और कोशिकाओं की कम संख्या के लिए कार्यात्मक अध्ययन अनुकूलन का उपयोग करना, हम की पहचान और FRT के विभिंन साइटों में dc के दुर्लभ सबसेट की विशेषता कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
श्लैष्मिक dc एक दुर्लभ कोशिका मजबूत ऊतक वातावरण है, जो उनके phenotype परिवर्तन और समारोह एक बार वे ऊतकों में प्रवेश के द्वारा प्रभावित आबादी रहे है3। जबकि रक्त व्युत्पन्न dc एक बहुत ही उपयोगी मॉडल हैं, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH पलाश AI102838 और AI117739 (CRW) द्वारा समर्थित अध्ययन. हम तकनीकी सहायता के लिए रिचर्ड Rossoll धंयवाद । प्रवाह cytometric विश्लेषण DartLab में किया गया था, Dartmouthsupported में साझा संसाधन द्वारा (P30CA023108-37) और (P30GM103415-15) ।
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
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