Summary
A abordagem de marcador trófica de ácido graxo, ou seja, a assimilação dos ácidos graxos como molécula inteira e transferência em tecido de consumidor com n ou menor modificação, é dificultado por lacunas de conhecimento no metabolismo de ácidos graxos de invertebrados de solo pequeno. Isotopólogo de criação de perfil é fornecida como uma valiosa ferramenta de desvencilhar interações tróficas.
Abstract
Ácidos graxos (FAs) são úteis biomarcadores em ecologia alimentar da web porque eles são normalmente assimilados como uma molécula completa e transferidos para o tecido do consumidor com menor ou nenhuma modificação, permitindo o roteamento dietética entre diferentes níveis tróficos. No entanto, a abordagem de marcador trófica FA ainda é dificultada pelo conhecimento limitado no metabolismo lipídico da fauna do solo. Este estudo utilizou inteiramente rotulado ácido palmítico (13C16:0, 99% de átomo) como marcador no ácido graxo vias de metabolismo de dois generalizada do solo Collembola, Protaphorura fimata e Heteromurus nitidus. Para investigar o destino e modificações metabólicas deste precursor, é apresentado um método de criação de perfil Isotopólogo, realizada por espectrometria de massa usando o único íon monitoramento. Além disso, o montante laboratório experiência de alimentação é descrito, bem como a extração e a metilação de fracções lipídicas dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) e a fórmula relacionada e cálculos. Isotopólogo de perfil não só rendimento o enriquecimento global de 13C em ácidos graxos derivado a 13C rotulado precursor mas também produz o padrão de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular de FA M+) de cada rotulado FA por uma ou mais unidades de massa (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.). Este conhecimento permite conclusões sobre o rácio de roteamento dietético de um FA inteiramente consumido em comparação com a biossíntese de novo . Isotopólogo perfil é sugerido como uma ferramenta útil para a avaliação do metabolismo de ácidos graxos em animais de solo de desvencilhar interações tróficas.
Introduction
Em um habitat enigmático como o solo, relações tróficas são difíceis de abordar e são ainda mais restritos pelo pequeno tamanho da fauna. A última década viu avanços na ecologia bioquímica, particularmente no uso de ácidos graxos como biomarcadores para definição de estratégias de alimentação da fauna de solo sob condições de campo a1,2,3. Isto é baseado no fato de que ácidos graxos de recursos podem ser incorporados no tecido do consumidor como moléculas inteiras, um processo denominado de roteamento dietético4. Transferência de ácidos graxos relatou sobre três níveis tróficos, ou seja, dos fungos para nematoides de Collembola5. Recentemente, a fauna predatória considerou-se6,7 e os primeiro comentários sobre os ácidos graxos como marcadores tróficas em solo tróficas foram publicadas8,9.
Informações mais detalhadas sobre interações tróficas são alcançadas por ácido graxo isótopo estável sondagem (FA-SIP). A determinação de 13C /12C rácios em ácidos graxos em dietas e os consumidores podem atribuem links binário e estimam o fluxo de carbono associado e tem sido empregados em terrestre, água doce e marinhos tróficas10,11 ,12,13. O pressuposto básico é que a dietéticos roteado os ácidos graxos não são sujeitas a processos enzimáticos; Portanto, seus 13C sinal, ou seja, a 13C /12C relação do ácido gordo, em que o consumidor é semelhante ao que na dieta1. No entanto, um empobrecimento gradual da assinatura 13C a cadeia alimentar tem sido relatado em sistemas aquáticos, dificultando, assim, ampla aplicação da FA-SIP em estudos trófica14,15,16. Além disso, o conhecimento no metabolismo lipídico na maioria dos invertebrados terrestres teias alimentares é ainda limitado.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. Com isto em mente, 13C-Isotopólogo de criação de perfil, que em princípio pode ser aplicado para investigação do metabolismo carbono de qualquer sistema biológico17, é um método promissor. Após a introdução de um substrato de carbono marcado com 13, a distribuição dos 13C na rede metabólica é rastreável desde os produtos metabólicos gerados no show do consumidor uma distribuição específica de Isotopólogo. Isto pode ser avaliado por espectroscopia de ressonância metabólica nuclear quantitativa18,19 ou20,espectrometria de massa21, com as último favorecido em amostras biológicas com baixa biomassa devido à sua maior sensibilidade.
Embora Isotopólogo de criação de perfil foi com êxito aplicada aos aminoácidos e forneceu insights sobre o metabolismo de carbono na vivo de patógenos bacterianos17,22,23, sua implementação em gordos ácidos já ficou para trás. A primeira análise detalhada sobre o destino de um isótopo estável rotulados precursor de ácidos gordos, sua dieta roteamento ou degradação através da β-oxidação, em consumidores de invertebrados de solo, foi recentemente realizada por Menzel et al 24. aqui, os princípios metodológicos para experiências de incorporação com 13C rotulados de ácidos graxos, seguidos de análise Isotopólogo de chaves descendentes em invertebrados de solo frequentes, o Collembola, são fornecidos. Estas variedade é um grupo de modelo bom como eles formam componentes importantes do solo comida web são bem investigado por seus marcador trófica ácidos graxos8,25.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. O presente protocolo dá o projeto e configurar para um laboratório de experimento e os processos bioquímicos de extração e metilação de frações de lipídios dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) de alimentação de Collembola. Ele demonstra como a Isotopólogo a composição de ácidos graxos é analisada por espectrometria de massa e descreve a fórmula relacionada e cálculos. Este procedimento resulta em: (i) os rácios de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular do ácido graxo M+) por uma ou mais massa unidades (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.) e (ii) total 13 C enriquecimento em ácidos graxos derivado o precursor rotulados de 13C. Embora usado para Collembola, esta abordagem geralmente pode ser aplicada a qualquer outra interação predador-presa na premissa de que estes são viáveis em quantidade suficiente sob condições controladas para garantir uma absorção bem sucedido rótulo e subsequente verificação.
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Protocol
O protocolo descrito não cai sob a competência da ética. No entanto, quando as pessoas se adaptar os protocolos descritos para os animais superiores, cuide que o Comitê de ética institucional aprovado o protocolo para manipulação de animais.
1. cultivo de animais
Nota: Tudo explicado etapas experimentais são baseadas em protocolos bem estabelecidos de27,26,28. Bioensaios em laboratório precisam de um fornecimento contínuo de organismos facilmente viáveis. Aqui, as espécies de Collembola, Protaphorura fimata (Gisin, 1952) e Hetermurus nitidus (Templeton, 1835) têm sido utilizadas. Ambas as espécies são simples de manter-se como culturas produtivas de laboratório alimentadas com fermento de padeiro.
- Em microcosmos de plástico com tampas apertadas montagem (diâmetro de 7 cm, altura 4,5 cm), adicionar uma mistura de carvão ativado, gesso e destilada água para fornecer um substrato de reprodução altamente úmido (figura 1A).
- Ao preparar a mistura de microcosmos bastante substrato, por exemplo, para 10 microcosmos em um lote. Mix 9 peças de gesso (225 g) e 1 parte de seco carvão ativado (25 g) junto em uma panela de gesso, adicionar cuidadosamente cerca de 10 partes de água destilada (250ml) e deixe para descansar por 5 minutos sem agitação à temperatura ambiente.
- Mexa com uma colher de laboratório a uma velocidade moderada no sentido horário para evitar bolhas de ar, até obter uma consistência espessa soupy. Despeje imediatamente em microcosmos de uma altura de cerca de 1 cm.
- Alise o gesso suave batendo no banco e agitação. Note-se que buracos (produtos aleatórios de bolhas de ar) e sulcos (ativamente adicionados com uma espátula estéril) podem encorajar Collembola fértil para pôr ovos lá. Este estudo evitar buracos e sulcos em favor de ter as mesmas condições reprodutíveis. No entanto, para fins de demonstração, figura 1B apresenta alguns buracos.
- Permitir a secagem por cerca de 1-2 dias à temperatura ambiente; incubação a 60 ° C pode reduzir esse tempo para 1-2 h.
- Umedeça o microcosmos antes de usar adicionando água da torneira com uma pipeta, até que o substrato estiver ligeiramente húmido. Mantenha o microcosmo húmidas, regularmente, adicionando água destilada como Collembola têm uma cutícula mole e é suscetível a dessecação.
- Transferência de Collembola facilmente à base de gesso, usando um simples tubo de sucção, ou seja, um tubo de silicone longo cerca de 25 cm de comprimento com a ponta da pipeta munidos de uma malha pequena para evitar a aspiração dos animais dentro do tubo. Em alternativa, transferi animais, permitindo-lhes a aderir sobre as cerdas de uma escova pequena.
- Transferência (consulte a etapa 1.2) 30 recém eclodidos Collembola em microcosmos novos e fornecer granulado seco fermento de padeiro de como alimento (sobre uma ponta de faca) (figura 1B); Renove pelo menos duas vezes por semana. Independente de plano três repetições por dia de amostragem; no presente estudo dias 0 - 7 e 14. Incube a 15 ° C na escuridão. Manter que uma temperatura constante é essencial, como os ácidos graxos são alterados por metabolismo animal para satisfazer os requisitos para a fluidez da membrana.
- Alimentar Collembola com fermento de padeiro por quatro semanas antes de iniciar os experimentos de exposição para obter uma homogênea 13C /12C sinal e padrão em ácidos graxos. Use um tubo de sucção ou uma escova para remover todos os ovos (Figura 1), pelotas fecais, e exúvia regularmente como animais pode se alimentam-los desse modo alterando seu perfil lipídico.
Figura 1: cultivo de Collembola. (A) microcosmo preenchido com reprodução de substrato, uma mistura seca de gesso, carvão ativado e água destilada. (B) e (C) amostra representativa de uma cultura de Protaphorura fimata ; Observe as pequenas pepitas de fermento seco de padeiro de utilizado como fonte de alimento e, também, como buracos no substrato fértil (seta preta) (B) bem como dois ovos (seta branca) (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. rotulagem de dieta, colheita e manuseio de amostras
- Rotulagem
- Quatro semanas após o estabelecimento das culturas de Collembola, coloque 30 indivíduos de cada novos microcosmos e incubar a 15 ° C na escuridão.
- Introduzir o rótulo de pulso alimentando-os de levedura de panificação contendo um inteiramente 13C-rotulados ácido palmítico (13C16:0, 99% de átomo) misturando 13C-rotulados ácido palmítico com fermento de padeiro com uma espátula em uma relação 0.5:1, por exemplo, 5 g 13 C16:0 e 10g seco fermento de padeiro. Coloque sobre uma ponta de faca em cada microcosmo.
- Após 6 h, substitua este rotulados alimentos com fermento padeiro completamente sem rótulo.
-
Cultivo mais
- Durante o curso do experimento renovar a cada três dias a dieta de levedura e adicionar montantes mais elevados do que o que Collembola consumirá dentro desse período. O mais importante, use um tubo de sucção ou uma escova para remover os ovos Collembolan, pelotas fecais e exúvia regularmente para assegurar a alimentação exclusiva pelos animais no alimento fornecido.
- Colheita
- Destrutiva da amostra microcosmos diariamente até o dia 7. Então, no dia 14, coletar três repetições independentes em cada tempo de amostragem; tempos de amostragem diferentes são possíveis.
- Prepare os tubos de vidro de 10 mL equipados com tampas de rosca Teflon revestido, uma para cada amostra. Previamente limpar esses tubos em uma máquina de lavar copos e enxaguar depois duas vezes com água desionizada. Finalmente, para remover quaisquer vestígios de hidrofóbicos poluentes lavam duas vezes, adicionando 2 mL de clorofórmio (grau HPLC), vórtice aproximadamente e descartar o solvente.
- Para amostras de controle (dia 0), tomar 3 30 não-expostos Collembola das culturas pre-como amostras do dia 0.
- Para amostras expostas (dia 1 e em diante), levar para as amostras diárias em cada caso 3 30 expostos Collembola das culturas intermediària alimentados com a mistura de 13C-rotulados ácido palmítico e fermento de padeiro.
- Registro Collembola peso fresco por um ultra-micro-balança. Transferência de animais usando um ventilador ou escova para escala-panelas adequadas. Para garantir a fácil manipulação de Collembola durante a pesagem na balança-panelas, choque-cool animais antes (-80 ° C durante 2 h). Alternativamente, um fluxo de CO2 por 10 min com segurança pode atordoar os animais.
- Diretamente após pesagem colocar animais do escala-panelas cuidadosamente para tubos de ensaio 10ml vidro. Encha os tubos com 1 mL de metanol (grau HPLC) e loja a-20 ° C até análise.
Nota: Desta etapa em diante, evitar a manipulação de amostra com equipamento plástico como solventes orgânicos estão envolvidos; em vez disso use pipetas que são apropriadas para solventes, bem como os vasos de vidro e dispensadores.
3. lipídios extração de tecido Animal e metanólise
- Prepare três-provetas de vidro (equipados com tampas de rosca de Teflon revestido) por lote contendo apenas 1 mL de metanol como valores em branco. Importante, adicionar ou transferir qualquer solvente utilizado no presente protocolo por pipetas de vidro ou dispensadores resistentes a solventes clorofórmio/metanol enxaguada.
- No início do processo de extração de lipídios, reduzir o metanol aplicado para armazenamento (ou anular) por evaporação; recomenda-se uma bancada compacta rotacional vácuo concentrador (RVC) equipado com uma bomba de vácuo e uma armadilha fria. Transferir os tubos abertos para o RVC e evaporar até secar a 50 ° C e vácuo pressão de 200 hPa por 20 min.
- Adicionar 5 mL de solvente de extração monofásica (chloroform/methanol/0.05 M 1:2:0.8 de tampão fosfato, pH 7,4) para cada amostra (incluindo espaços em branco) e extrair lipídios Collembolan à temperatura ambiente por agitação durante a noite (~ 200 rpm).
- Transferir o solvente para tubos novos e re-extrair amostras agitando para 3h com um adicional 2,5 mL de solvente de extração. Depois disso, combinar extractos de ambas as etapas; recomenda-se o uso de pipetas Pasteur de vidro. Adicionar 0,8 mL de clorofórmio e 0,8 mL de água destilada, em seguida, misture e centrifugar a 2.000 g a 20 ° C por 5 min. Finalmente, permitir amostras repousar durante 5 min para a separação de aquoso e clorofórmio fases.
- Para análise de padrões de ácidos graxos, divida os lipídios celulares totais de Collembola em lipídios neutros, Glicolipídio e frações de fosfolipídios.
- Para cada amostra, preparar uma coluna de sílica ácido (coluna comercial com 0,5 g ácido silícico, malha tamanho 100-200 µm, consulte Tabela de materiais), adicionando 1 mL de clorofórmio (pré-condicionamento). Para acelerar este processo, monte as colunas em um bloco de vácuo como é comumente usado em cromatografia para extração de fase sólida. Não utilize agulhas de nylon; Use aço inoxidável acima dos tubos.
- Após o clorofórmio utilizado para pré-condicionamento passou através da transferência de coluna a fase de clorofórmio inferior completa de cada amostra para uma coluna individual. Para simplificar este procedimento, a fase aquosa superior pode ser removida previamente. Usar pipetas Pasteur de vidro, no entanto, cuidar para que as colunas não secar.
- Sucessivamente eluir fracções lipídicas com 5 mL de clorofórmio (incluindo neutro lipídios ácidos graxos, NLFAs), 10 mL de acetona (glicolipídios - não analisados neste projeto) e 5 mL de metanol (incluindo ácidos graxos de fosfolipídios, PLFAs). Recolha cada fração em vasos de vidro individuais.
- No final da extração, reduza o clorofórmio (NLFAs) e o metanol (PLFAs), através da evaporação em um RVC. Transferir os tubos abertos para o RVC e evaporar até secar, ~ 90 min a 60 ° C e um vácuo de 24 hPa.
- Começar a saponificação de lipídeos (NLFA e PLFA fracções) seguindo o protocolo de Welch (1991)29 com adição de 1 mL de solução de hidróxido de sódio-metanol (45 g de hidróxido de sódio, 150 mL de metanol e 150 mL de água destilada) e incube a 100 ° C por 30 min em um banho de água. Refrigerar a amostra em água gelada por 2 min, em seguida, colocar as amostras no banco e continuar a trabalhar na temperatura ambiente.
- Adicione o padrão interno para cada amostra, incluindo os espaços em branco. Escolher um ácido graxo não comum nos organismos experimentais; também use um ácido gordo saturado para minimizar a perda por clivagem e selecione uma molécula com cadeia-comprimento intermediário. Para muitos propósitos, o ímpares nonadecanoic ácido (0:19) funciona bem. Então, adicione 30 µ l de uma solução de 0,74 mM em isooctano. A quantidade exata é muito importante - não se esqueça de verificar a precisão da sua pipeta com uma micro-balança antecipadamente.
- Adicionar 2 mL de ácido clorídrico-metanol (mistura de 325 mL de 6,0 N de ácido clorídrico com 275 mL de metanol), incubar a 80 ° C por 10 min em um banho de água e esfria rapidamente no gelo por 2 min. Esta etapa é hora e temperatura sensível; usar 80 ± 1 ° C e 10 ± 1 min. cheque com quantas amostras podem ir para o banho de água de uma só vez para manter a 80 ° C.
Nota: Este procedimento resulta em ésteres metílicos de ácidos gordos (FAMEs), ou seja, ácido graxo analitos estabilizados para vaporização em cromatografia gasosa. - Finalmente, adicione 1,25 mL de hexano/metil terciário butílico (1:1) e rocha suavemente durante 10 min, em seguida, centrifugar 2.000 g por 5 min. Retire a fase inferior e manter a fase superior é composta por FAMEs; Use pipetas Pasteur de vidro. Adicione 3 mL de hidróxido de sódio aquoso (10,8 g de NaOH dissolvido em 900 mL de água destilada) para uma etapa de lavagem.
- Rocha e centrifugar novamente.
- Leve a completa contendo lipídios fase superior usando uma pipeta Pasteur de vidro e transfira para um frasco de amostra de cromatografia gasosa equipado com um septo de Teflon. Evite incluindo pequenas quantidades de fase aquosa, pois isto causará problemas com a medição de GC. Encapsular o frasco e armazenar a-20 ° C até análise.
4. quantificação de ácidos graxos por GC-FID
- Use cromatografia gasosa para identificar e quantificar as FAMEs nas fracções NFLA e PLFA de lipídios Collembola (animal). Um cromatógrafo a gás (GC) equipado com detector de ionização de chama (FID) é um equipamento estabelecida e comprovada de30.
- Para identificação da FAMEs, compare o tempo de retenção dos picos da amostra para aqueles em um padrão de fama. Estas são a mistura padrão qualitativa ou quantitativa da chave FAMEs, cobrindo uma variedade de produtos alimentares e organismos.
- Emprega misturas padrão fama, composto por representante de FAs para o grupo de organismo investigadas e dieta experimental. Em Collembola, estes são característicos de ácidos graxos para eucariontes, por exemplo, ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa como o ácido araquidônico (20:4ω6). Quando empregando levedura como dieta são marcadores de fungos, tais como o ácido linoleico (18:2ω6). Uma boa opção é o so-called mix fama, compreendendo 37 diferentes ácidos graxos frequentes em animais, fungos e material vegetal e o éster metílico de ácido bacteriana (Erika) misturam (ver Tabela de materiais).
- Para executar as amostras em GC-FID, configure uma sequência com o respectivo software do instrumento. Para obter instruções, consulte o manual do fabricante. A sequência começa com as externas misturas padrão (por exemplo, fama e Erika mix), seguidas das amostras. Observe que há uma mudança de tempo de retenção, ou seja, um ligeiro atraso no tempo de eluição dos ácidos graxos da coluna GC com cada corrida, durante a execução de amostras! Quer incluir um padrão de cada 10th executado na sequência de amostra ou usar o tempo de retenção de bloqueio para o ácido palmítico (16:0).
- Adapte o GC valores dependentes do instrumento. O programa a seguir é sugerido para uma coluna capilar de alta performance (HP) (25 m x 0,2 mm identificação, película de espessura 0,33 µm. volume de injeção de Set a 1 µ l no modo splitless e usar o hidrogênio como gás de transporte. Emprega um início de programa de temperatura a 50 ° C (realizada por 1 min) e aumentando em 25 ° C min-1 a 175 ° C, seguido de 3 ° C min-1 a 230 ° C (realizada por min 5,7).
- Calcule o ácido graxo nmol por grama de peso (seco) fresca de organismos usando a resposta obtida pelo FID para cada fama aplicando as quantidades conhecidas para os respectivos ácidos graxos usando a seguinte fórmula:
Umafama: a área do pico da fama respectiva na amostra
MWFM: Peso Molecular da fama respectivo em µ g/µmol
CIS: concentração do padrão interno em µ g
Umaé: a área do pico do padrão interno
mCol: peso (seco) fresco do respectivo amostra de Collembola em g
1000: fator de conversão de µmol de nmol
cBW: concentração da fama respectiva na média dos valores em branco correspondentes em nmol
5. análise de 13C por Isotopólogo de perfil
- Use um sistema de GC acoplado a uma massa seletiva Detector (MS) fornecido com uma fonte de ionização (EI) do elétron para determinação de Isotopólogo.
- Use uma coluna capilar polar (por exemplo, 23 DB, CP-Sil 88) como esta ainda permite a separação de ácidos graxos insaturados, mesmo com os mesmos números de ligações duplas. A escolha da coluna GC é crítica para os resultados, como determina a boa representação do íon molécula em ácidos gordos.
- Para uma coluna de 23 DB (60 m x 0,25 mm identidade, filme espessura 0.15 µm), começa a temperatura do forno a 130 ° C e aumentar em 6,5 ° C/min a 170 ° C. Siga com um aumento de 3 ° C/min a 203 ° C e segure para 1,9 min. siga com um aumento de 40 ° C/min até 230 ° C e segure para 8,3 min. temperatura de linha Set transferência para 280 ° C. Novamente, ajuste o método GC para o instrumento.
- Use padrões quantitativos composto por quantidades conhecidas da FAMEs para todos os ácidos graxos para ser investigado por incorporação de 13C. Coloca estas normas no início e no final de cada sequência de exemplo executar. Leve os tempos de retenção dos ácidos gordos de interesse destas normas.
- Medir as amostras das experiências de sempre, começando com as amostras sem rótulo e as sondas marcadas posteriormente. Aplicar uma relação de separação apropriada para as concentrações de amostra, por exemplo, 1:12.5.If disponível para o instrumento, aplicar um proc com hélio após cada amostra executar tirar da coluna de analitos restantes.
- Aplica o tempo de retenção de bloqueio para o método de GC-MS para que a aquisição de SIM não sofre deslocamento e há tempos de retenção do analito pode ser reproduzido.
- Determine a incorporação de 13C no íon molecular de ácidos graxos por GC/EI-MS usando o íon selecionado modo (SIM) do instrumento de monitoramento. Operação em modo SIM permite para detectar analitos específicos com maior sensibilidade em relação ao modo de varredura completa.
- Execute uma varredura inicial primeiro para ver o que está presente e SIM em íons apropriados. Aquisição de dados em massas moleculares de interesse selecionando windows de verificação de m/z (grupos SIM) abrangendo o tempo de pico cromatográfico de ácido graxos respectivo. Normalmente, monitore duas a quatro íons por analito e tempo de janela.
- A fim de aumentar a sensibilidade, ajustar a taxa de digitalização em massa e Habitai vezes (o tempo gasto olhando para cada massa). Os melhores dados de qualidade são obtidos na menor velocidade possível e um geralmente regra no SIM acabou o pico de analito varreduras de 8 a 12. Um proxy para ajustes do instrumento é um tempo de permanência média por massa de 9 ms, um tempo de ciclo de 6 s e um tempo de varredura de 175 ms cyle-1.
- Detecta o íon molecular (M.+) dos respectivos ácidos graxos e todos os seus isotopologues (M+ 1, M+ 2 e assim por diante). Para obter exemplos, consulte representante resultados.
- Recorde a abundância de cada fragmento de íon (Isotopólogo). Observe que a abundância do íon da molécula e sua isotopologues é relativamente baixa e a qualidade de quantificação depende grandemente o desempenho do sistema de MS. Executar uma música antes de iniciar uma sequência de amostra grande (experimento) e se necessário, limpe a fonte de íon.
Nota: Em primeiro lugar, estes dados rendem global 13C avanços de cada ácidos graxos pelo precursor consumido (aqui 16:0). - Use a proporção da composição isotópica de ácidos graxos de rotulados de suas contrapartes não marcadas para atribuir o fluxo de carbono trófica. Use a fórmula de % do átomo na etapa 6.1 para calcular a porcentagem do carbono rotulado (átomo por cento, átomo %) no respectivo ácido graxo. Compare a porcentagem de 13C em ácidos graxos de Collembola entre rotulados (dia 1 e posterior) e animais sem rótulo (dia 0) como indicação relativa para o fluxo de 13C de dieta para o consumidor.
- Atribua a posição de 13C incorporação da cadeia do ácido graxo. Baseada na distribuição de desvencilhar das isotopologues o roteamento dietética do ácido gordo todo marcador marcado (16:0 aqui) do alongamento de cadeia pelo metabolismo de lipídios. Enquanto a abundância de isotopologues mais distante ao pai íon (M+), por exemplo, aumenta a assimilação da molécula inteira marcador M+ 15, M+ 16, com alongamento de cadeia pelo uso de 13C rotulados C2 fragmentos (13C acetil-CoA) os isotopologues perto o íon molecular obter mais frequentes.
6. cálculos de enriquecimento 13C
- De acordo com a distribuição da isotopologues, calcular a percentagem global de carbono rotulado (no átomo %) no respectivo ácido graxos usando a seguinte relação: átomo % = (relação 13C Isotopólogo incorporado) x (frequência respectivo Isotopólogo)
Isto é calculado após et al . Kuppardt 31 como:
onde N é o número de átomos de carbono em ácido graxos, J é o número de isótopos de 13C, M + J é a abundância dos respectivo Isotopólogo e umT a abundância total de todos os isotopologues. - Para cálculo, soma os pico área valores do íon molecular (M.+) dos respectivo FA e todos os isotopologues (M+ 1M+ 2e assim por diante), detectada por análise SIM-MS e definir a abundância relativa de 100%. Calcule que a parcela de cada Isotopólogo detectado é facilmente seguindo a regra de três.
- Subtrai o valor do controle não rotuladas dia 0 (fundo natural 13C) dos valores experimentais para obter dados finais só rastreados até o externo realizada 13C-rotulagem.
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Representative Results
Índice de peso e lipídios fresco de Collembola
Durante o experimento descrito, o conteúdo em NLFAs e PLFAs não mudou significativamente ao longo do tempo, Considerando que o peso fresco de espécimes aumentou ligeiramente, mas não significativamente24. Ambos os parâmetros indicam um bom nível de aptidão física dos espécimes Collembola. Estar ciente para investigar peso e lipídios índice fresco do Collembola durante todo o experimento correspondente dos dias de amostragem em ácidos graxos e análise isotópica. Observe que uma perda de peso e/ou uma diminuição do teor lipídico durante o período experimental indicam uma redução da aptidão do organismo teste e os dados derivados drasticamente perdem o significado.
Deteção de Isotopólogo
O significado especial de Isotopólogo projetos de criação de perfil encontra-se na individual detecção e quantificação de todos os isotopologues em um ácido graxo específico e o íon molecular. Por exemplo, no caso de 16:0 os íons variam de 270, ou seja, Íon molecular M+ (C esqueleto composta principalmente de 12átomos de C) a 286 (Isotopólogo M+ 16 - cadeia de carbono completamente substituída com o pesado 13. C). Figura 2A apresenta um espectro de SIM-MS de puro 16:0, ácido palmítico. A abundância natural de 13C neste composto torna-se detectável pela presença de M+ 1 e M+ 2 isotopologues além do íon molecular (M.+). Em comparação, a Figura 2B mostra o espectrograma do ácido palmítico inteiramente rotulado (átomo 99% 13C) utilizado neste estudo. Aqui, a ocorrência exclusiva do íon M+ 16 reflete a pureza elevada deste sinteticamente rotulado composto.
Figura 2: exames SIM representante de ácido palmítico puro do (A) sem rótulo e (B) inteiramente etiquetado. Observe a abundância natural de M+ 1 e M+ 2 isotopologues além do íon molecular (M.+) sem rótulo C 16:0 (A), mas a presença exclusiva do M+ 16 Isotopólogo no ácido graxos inteiramente rotulado (99-átomo % 13. C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Alongamento/dessaturação contra de novo síntese
Depois da colheita, os organismos de teste, extração de lipídios e derivatização, as FAMEs gerados estão prontos para ser analisado por GC e SIM-MS. Através de um exame de Isotopólogo dados de perfil, um pode agora distinguir entre síntese de novo e dessaturação/alongamento eventos do ácido gordo marcador rotulado inteiro. O primeiro pode ocorrer, pelo menos parcialmente, com base em 13C acetil-CoA como produto de degradação do precursor rotulado através de beta-oxidation. A Figura 3 mostra exemplos representativos dos scans SIM derivados quatro ácidos graxos dominantes, na fração de PLFA de H. nitidus no primeiro dia de amostragem após a rotulagem. A assimilação da molécula marcador rotulados em ácido palmítico torna-se visível pela abundância da M+ 16 - Isotopólogo, pois representa o ácido graxo inteiramente rotulado (Figura 3A - 0:16). Além disso, a dessaturação de 16:0 (Figura 3B - 16:1ω7) ou de alongamento além de dessaturação (Figura 3 - 18:1ω9, Figura 3D - 20:4ω6) pode ser atribuído. Desse modo, a detecção de isotopologues maior que M+ 16, por exemplo, M+ 17 e M+ 18 demonstram a elongação da cadeia do precursor rotulado 16:0 pelo uso de 13C2-fragmentos. Biossíntese de novo com base em 13de ácidos graxos, acetil-CoA C é indicado se isotopologues perto o íon molecular, i.e., M+ 1 M+ 2 entrar significativamente mais frequente do que o controle representado pela amostragem de dia 0.
Figura 3: Scans de representante SIM (monitoração de íon selecionado) de íons de fragmento em ácidos graxos de Heteromurus nitidus (fração PLFA, 1 dia após a rotulagem). (A) o ácido palmítico ácido palmitoleico (B) de (16:0) (16:1ω7) (C) ácido araquidônico ácido oleico (18:1ω9) e (D) (20:4ω6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Mais ilustrando isso, a Figura 4 compara o padrão de Isotopólogo inicial dos cinco ácidos graxos mais fortemente rotulados (analisados em PLFAs e NLFAs); em comparação, são os dados provenientes das espécies de Collembola, fimata p. no dia 0 e 1. No dia 1, o sinal de C 13C16 e C18 FAs baseou-se quase inteiramente sobre a ocorrência do íon M+ 16molécula, resultando de inteiramente rotulado 13C 16:0, complementada com a comida. Como mencionado acima, os traços observados de M+ 18 18:0 e 18:1ω9 sugerem a introdução de uma porção menor de 13C acetil-CoA através de alongamento da cadeia de 16:0 18:0. Para 18:1ω9 isto foi mais pronunciado em facção PLFA. Tais 13C acetil-CoA deriva de β-oxidação de moléculas de rotulado 13C 16:0. Incorporação de 13C acetil-CoA também ocorreu na etapa de alongamento do comprimento de cadeia C18-C20, como atribuído pelo 20:4ω6 das amostras PLFA. Desse modo, o enriquecimento de 13C em M+ 16 e M+ 18 aumentou significativamente com o tempo até dia 14 (Figura 4). Além disso, M+ 2 desta 20:4ω6 PLFA no dia 14 aumentou em relação ao dia 0 ou 1. Esta atribuição de 13C no isotopologues diferente indica que a formação de 20:4ω6 é baseada tanto na síntese de novo , com inclusão de acetil-CoA rotulado com 13C ou em abundância natural 13C e o alongamento/dessaturação da molécula precursora inteiro 13C16:0. Em contraste, 20:4ω6 claramente rotulado não apareceu na fração NLFA (Figura 4).
Figura 4: Isotopólogo padrão da incorporação pelo SIM (monitoração de íon selecionado) 13C. Apresentadas são as porções relativas dos íons M+ 1 a M+ 3 e M+ 16 M+ 20 dos cinco mais fortemente rotulado NLFAs e PLFAs de Protaphorura fimata, estima-se no dia 0 e 1. Apenas para 20:4ω6 os dados de 14 dia são apresentados além disso. P< 0,05 (teste de Dunnett com dados dia 0, usados como referência). Esta figura é uma reedição da Figura 5 , publicado em Menzel et al 24 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Isotopólogo de perfil
Uma análise detalhada dos aspectos quantitativos em distribuição de 13C no FAs precisa de tecnologia de ponta para atribuir carbono particionamento em teias alimentares. O presente trabalho empregado Isotopólogo de criação de perfil para avaliar a 13C /12C rácios em comuns biomarcadores de FA para interações tropicais. Esse método é bem estabelecido para a análise de aminoácidos por cromatografia líquida (LC-MS) e foi aplicado para as investigações do metabolismo do carbono em bactérias patogênicas17,23. Apenas recentemente, Isotopólogo de criação de perfil mais tarde desenvolvida como uma ferramenta para estudar dietética roteamento de lipídeos em invertebrados de solo pequeno por Menzel et al 24 desde que este método não é dificultado por no colo"sobre" do sinal 13C, portanto, é vantajoso para a avaliação do tecido orgânico altamente enriquecido com um isótopo específico em relação ao GC-C-IRMS32.
Com esta abordagem, os valores de massa-de-carga (m/z) no íon molecular e sua isotopologues é determinado por GC-MS usando o modo de EI e SIM. Em comparação com a varredura completa, a sensibilidade no SIM pode ser aumentada pelo fator 100, que supera até mesmo a quantificação de GC-FID gama33. Além disso, pela aquisição de um grupo específico de íons em uma janela de tempo determinado, o analito é mensurado fiavelmente apesar de um fundo de co de eluição picos30. Thurnhofer e Vetter34 provou que SIM é apropriado para a identificação de FA e quantificação, em amostras de alimentos, mesmo com baixas quantidades de lipídios disponíveis.
Quando usando o SIM para 13C Isotopólogo perfil de pelo menos duas restrições metodológicas devem ser considerados. Em primeiro lugar, os íons moleculares são de relativamente baixa abundância e seus isotopologues são ainda menos. Com uma fonte de íon sujo, estes tornam-se menos abundantes e como consequência o método SIM só será semi-33. Em segundo lugar, a maior ocorrência de 13C em uma ou mais posições de carbono da FA diminui a 13C abundância natural de átomos de carbono associados. Essas alterações com rotulagem são não-lineares, um fenômeno chamado "inclinação" em abundância natural, que pode levar a subestimação do enriquecimento a essas massas20. Este efeito de inclinação deve ser contabilizado usando uma matriz de correção baseado em padrões de fama (ver Fernandez et al) ou incluindo controles naturais, ou seja, FAs de organismos experimentais sem rótulo. Este último realizou-se no presente trabalho comparando a mesma FA em rotulados (dia 1 e posterior) e não rotuladas Collembola (dia 0).
Dietético roteamento e 13C fluxo
Enquanto as vantagens metodológicas dos perfis de Isotopólogo para determinação de 13C no FAs são óbvias, no vivo metabolismo dos organismos pode ser prejudicado pelos meios biológicos. Isotópico e metabólico estado estacionário são difíceis de alcançar quando, por exemplo, uso de dieta ou o estado fisiológico dos consumidores não são conhecidos, dificultando a obtenção de fluxos de carbono absoluto. No entanto, comparando os perfis de 13C isotopologues da FAs na dieta e o consumidor, a proporção relativa de assimilação de FA e vias metabólicas pode ser obtida. Esta abordagem permite seguir o destino específico de um marcador de FA baseado em seu rótulo 13C traçando seu roteamento dietético. MS-SIM demonstrou que o marcador de FA foi roteado principalmente em frações NFLA de ambas as espécies analisadas de Collembola24. Além disso, o marcador de FA foi armazenado em lipídeos neutros com apenas menor ou nenhuma modificação. Foram detectadas apenas alongamento da dietética 13C16:0 18:0 e dessaturação com os equivalentes de monoenoic (ver Figura 4). A presença do íon M+ 16 no C16 e C18 FAs de amostras dia 1 confirma que essas FAs são descendentes do complementado inteiramente rotulados ácido palmítico. Esta constatação serve de base para estudos anteriores que foram baseados no padrão de consumo de FA e dieta de5,unicamente35 e sugere que FAs de marcador são incorporados como moléculas de toda tecido de consumidor (para uma revisão, ver Ruess e Chamberlain.8).
Entretanto, o padrão de 13C Isotopólogo de PLFAs revelou que o aumento observado em 13C20:46 ao longo do tempo devido alongamento/dessaturação de precursor inteiramente rotulado FAs e síntese de novo com o último também incluindo 13 C rotulado acetil-CoA, como indicado pela presença de M+ 18 traços de íons em C20 e também FAs C18 (ver Figura 4). Figura 5 resume o roteamento dietético de completados 13C16:0 dentro PLFAs e NLFAs das espécies observadas Collembola. Curiosamente, apenas 13C palmítico Ácido de PLFAs está sujeita a alterações mais fortes, Considerando que a transformação metabólica nos NLFAs permaneceu limitado a apenas um alongamento e duas etapas de dessaturação.
Figura 5: Destino da dietética 13C ácido palmítico em lipídios consumidor. O flow-charts mostrar o destino proposto de incorporado 13C16:0 na espécie Collembola investigada. As setas simbolizam os diferentes níveis de volume de negócios metabólica com espessura diferente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para resumir, Isotopólogo de criação de perfil por MS-SIM mostra claramente que usam FA como marcador trófica é um método robusto e confiável na ecologia de teias alimentares. Embora o desenho experimental não permitiu a quantificação precisa do fluxo 13C (por exemplo, como átomo % 13C da FA completado) para as diferentes etapas nas vias do metabolismo de FA, Isotopólogo de criação de perfil é uma ferramenta útil para todos os estudos ecológicos usando ácidos graxos como marcadores tróficas. Uma meta para o futuro é obter um consumidor quantitativo orçamento de carbono FA usando sistemas fechado microcosmo e alimentar os consumidores definidas quantidades de rotulado precursores de ácidos graxos.
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Acknowledgments
O apoio financeiro da R. Menzel e L. Ruess pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) é reconhecido com gratidão. R. Nehring foi financiado por RU 780/10-1. Finalmente, somos extremamente gratos ao Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke para revisão de nosso manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | --- | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
References
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